En este proyecto se pretende analizar la microbiota presente en el queso Cotija artesanal madurado, a través de métodos dependientes e independientes de cultivo; entre estos últimos, PCR, PCR-DGGE y FISH, como continuación de proyectos previos de este grupo de trabajo._x000D_ El queso Cotija es de manufactura artesanal y tiene su origen en la sierra entre los estados de Jalisco y Michoacán. Su particularidad es que al ser un producto elaborado a partir de leche cruda de vaca, su maduración ocurre mediante la interacción de la microbiota natural del producto que evoluciona libremente durante un tiempo mínimo de tres meses y que puede prolongarse hasta años. Estudios de este grupo de trabajo han demostrado que existe una gran diversidad de microorganismos que están presentes en el queso y que pueden provenir ya sea de la sal adicionada, de la atmósfera del local en el que se lleva a cabo la maduración y del contacto con el productor, principalmente. Este queso es de gran formato (26 cm diámetro x 17 cm alto), por lo que se espera que exista un gradiente en la composición fisicoquímica de la pieza desde el centro hasta la corteza, especialmente en lo relativo a la actividad acuosa, pH, potencial redox, acidez, etc. Dichos parámetros definirán a la microbiota presente en los estratos, lo que puede repercutir en un diferencial en actividades enzimáticas durante el proceso de maduración. Existen varias estrategias para poder demostrar la hipótesis, y estamos particularmente interesados en la utilización de métodos independientes de cultivo para poder definir la composición bacteriana en los diversos estratos del queso. Por estudios previos, sabemos de la existencia de bacterias de los géneros Enterococcus, Lactobacillus, Staphylococcus, Bacillus, Vagococcus y Marinilactibacillus, sin embargo no hemos podido aislar a algún miembro de los dos últimos géneros. Como alternativa al cultivo en placa, analizaremos la microbiota a través del método FISH (hibridización fluorescente in situ), con el que podremos determinar presencia y dominancia de los géneros mencionados con relación a una distribución espacial en la pieza de queso. Este método se ha aplicado con éxito en el análisis de muestras sólidas como biopelículas y existen algunos reportes de su aplicación en el análisis de alimentos, principalmente para la detección de patógenos. _x000D_ Otro método independiente de cultivo que hemos utilizado en el grupo de trabajo es la separación de amplicones del gen ribosomal 16S, a través de una electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (PCR-DGGE). Posteriormente se secuencian las bandas separadas con lo que se logra obtener información de la diversidad e identidad de un ecosistema microbiano. Éste es otro método independiente de cultivo, que resulta muy práctico para comparar varias muestras simultáneamente. Como ya se mencionó el queso Cotija tiene su origen en los estados de Jalisco y Michoacán, sin embargo en el estado de Chiapas (particularmente en la ciudad de Tonalá) se produce un queso “tipo” Cotija. Hasta la fecha no se ha hecho un estudio que los compare ni química, ni microbiológicamente, por lo que utilizaremos el método anteriormente descrito para averiguar la composición de la microbiota que está presente en varias muestras de quesos de ambos lugares de producción. Así mismo, se realizará el análisis químico correspondiente._x000D_ Las bacterias del género Enterococcus, han resultado de interés en este proyecto, debido a su abundancia y a que producen proteínas con actividad contra patógenos, como S. aureus. Por lo anterior, pretendemos continuar con la caracterización bioquímica más profunda de las enzimas que son producidas por una cepa particular de este género que aislamos del queso Cotija. Enterococcus faecium y faecalis se encuentran presentes en un sin número de alimentos fermentados tradicionales, sin embargo, no sería correcto ignorar que también pueden ser patógenos. Por lo anterior, también es de nuestro interés hacer un análisis extensivo para buscar la presencia de genes que codifiquen para factores de virulencia, así como para las enzimas responsables de la actividad antibacteriana antes mencionada.

Desde hace más de 10 años, las herramientas moleculares para investigar la composición de comunidades microbianas han sido ampliamente usadas para el análisis de ecosistemas de suelo o agua. Sin embargo, la aplicación de los métodos independientes de cultivo para el estudio de sistemas microbianos en alimentos comenzó hace unos pocos años, sobre todo en el análisis de alimentos fermentados tradicionales. Debido a que no se agregan cultivos iniciadores, existe el interés de identificar la biodiversidad en ese tipo de productos no sólo por razones de inocuidad, sino también porque las características finales del producto (sensoriales y de composición química) van a estar influenciadas por la microbiota presente durante el proceso de manufactura. Esto es muy relevante cuando se llega al punto de demostrar la autenticidad y a otorgar elementos de protección industrial, como la Denominación de Origen._x000D_ Particularmente, aquí estamos estudiando a un alimento con características de composición y sensoriales únicas, que tiene una fuerte raíz histórica, pero que está en riesgo de desaparecer por la competencia con productos “tipo” Cotija, que difieren enormemente en calidad y composición del auténtico. El que este queso se elabore con leche no pasteurizada, con las consecuentes dudas sobre su inocuidad, tampoco ha permitido que se avance en su comercialización. Por ejemplo, todavía sigue en revisión la Norma cuya función sería su regulación y la estandarización de su proceso de elaboración. Por lo anterior, este trabajo pretende seguir aportando información que ayude a esclarecer la inocuidad del producto, así como sobre su autenticidad. De igual forma, la producción de enzimas que inhiben el crecimiento de patógenos es un área de investigación biotecnológica con alto potencial de aplicación.