I. La hipótesis de nuestra investigación es que la diferenciación celular se da como respuesta a una tensión oxidante. Por una parte, la anulación de genes antioxidantes aumenta el estrés y estimula los procesos de diferenciación celular de Neurospora crassa. Así la cancelación del gen cat 1 afecta la germinación de las esporas asexuales (conidios), la pérdida del gen cat 3 estimula la esporulación asexual y sexual y la anulación del gen cat 2 aumenta la esporulación sumergida. CAT 2 es una enzima bifuncional, tiene tanto actividad de catalasa como de peroxidasa. CAT 1 y CAT 3 son enzimas monofuncionales, sólo tienen actividad de catalasa. Sin embargo, hemos detectado que el dominio C terminal de estas catalasas de subunidad grande tienen actividad de chaperona, pues evitan que otras proteínas y la propia catalasa se desnaturalicen en condiciones de estrés. Por otro lado, la anulación de genes prooxidantes disminuye la tensión oxidante e inhibe o anula los procesos de diferenciación celular en este hongo. N. crassa tiene dos genes de oxidasa dependiente del NADPH, nox 1 y nox 2, y varios genes reguladores, nor 1, rac 1, bem 1. La NOX produce superóxido y, por dismutación de éste, peróxido de hidrógeno. La anulación de nox 1 inhibe la esporulación asexual y anula la sexual; la cancelación de nox 2 elimina la germinación de las esporas sexuales (ascosporas) y con la pérdida de nor 1 se suman el fenotipo de nox-1 y de nox-2. La proteína RAS 1 es una proteína G pequeña que está relacionada con el estrés oxidante y que interacciona con varias vías de señalización. Pensamos que RAS-1 determina a través de las vías de señalización si, ante un estrés oxidante, la célula continúa creciendo o inicia el proceso de esporulación. La mutante ras 1bd provoca que N. crassa crezca y esporule de manera periódica. El objetivo de este proyecto es estudiar la función de las catalasas, de las NOX y de RAS 1 en relación con sus efectos sobre los procesos de diferenciación celular de N. crassa. En el caso de las catalasas (CAT 1 y CAT 3), en las que hemos determinado su estructura cristalográfica, mutaremos algunos aminoácidos específicos y analizaremos su efecto in vitro y, en algunos casos, in vivo. Además expresaremos en N. crassa distintas partes de la CAT-1 para separar in vivo la actividad de catalasa de la de chaperona. En colaboración con el laboratorio del Dr. Alejando Sosa estudiaremos la dinámica molecular de la entrada del sustrato y la salida de los productos en la CAT 1. En el caso de la catalasa-peroxidasa (CAT 2) separaremos la actividad de catalasa de la de peroxidasa y analizaremos su efecto in vivo. Para algunos experimentos de enzimología contaremos con la colaboración del Prof. Christian Obinger en Viena y con la colaboración del laboratorio del Prof. Ignacio Fita de Barcelona se intentará cristalizar y determinar la estructura cristalográfica de la CAT 2. Para el caso de las NOX estudiaremos la bioquímica de estas enzimas y de sus mutantes. Contamos para esta parte del proyecto con la colaboración del laboratorio del Dr. Jesús Aguirre. En el caso de RAS 1 analizaremos las vías de señalización a través de las cuales esta proteína favorece el crecimiento o la esporulación y el efecto que tiene la mutación bd en dichas vías y en la diferenciación celular. El proyecto, planteado para dos años, será parte de una tesis de licenciatura, una de maestría y una de doctorado. Asimismo, este trabajo experimental, dependiendo de los resultados, dará lugar a una, dos o tres publicaciones en revistas de prestigio internacional y también presentaciones en congresos nacionales e internacionales.

El proyecto, planteado a dos años, contribuirá al conocimiento de la relación estructura función de las catalasas y de la catalasa-peroxidasa, de la bioquímica de estas enzimas, de las NADPH-oxidasas y de proteínas reguladoras como RAS-1 y otras proteínas que actúan a través de varias vías de señalización. Este conocimiento está relacionado con la función de estas actividades en los procesos de diferenciación celular de Neurospora crassa, que es lo que nos interesa en primera instancia. El proyecto contribuirá también a la superación académica de un becario posdoctoral, un técnico académico y cuatro estudiantes. Será parte de una tesis de licenciatura, una de maestría y dos de doctorado. Asimismo este trabajo experimental, dependiendo de los resultados, dará lugar a una, dos o tres publicaciones en revistas de prestigio internacional.