El compuesto oseltamivir fosfato, comercialmente conocido como Tamiflú, es un potente inhibidor de las neuraminidasas presentes en el virus de la gripe. Este compuesto ha sido utilizado con éxito paras el tratamiento de casos de influenza aviar H5N1. Este antiviral es actualmente sintetizado utilizado como materia prima al compuesto ácido(-)-shikimco (SHK), el cual se obtiene tradicionalmente extrayéndolo del anís estrella chino. Se prevé que en caso de una pandemia de influenza aviar, la cantidad de SHK existente a nivel mundial en la actualidad no podrá abastecer la demanda mundial parea la síntesis de Tamiflú. Una alternativa para la obtención de SHK es su producción biotecnológica por medio de fermentación con microorganismos. La ventaja de esta alternativa es que un proceso fermentativo pude ser escalado para contender más eficientemente con la demanda del producto deseado. Como un primer resultado en este contexto, en nuestro grupo de trabajo hemos iniciado un proyecto de investigación apoyado económicamente por CONACYT (Proyecto CONACYT Fondo Salud 44126), cuyo primer objetivo fue la obtención de una cepa de E. coli sobreproductora como resultado de la inactivación de las enzimas que utilizan el SHK, incremento del flujo de carbono hacia la síntesis de compuestos aromáticos e incremento la disponibilidad de los precursores metabólicos para esta vía. Estas modificaciones se realizaron por inactivación de genes cromosomales y sobre expresando genes que codifican enzimas limitantes de la vía del SHK. Como resultado se obtuvo una cepa de Escherichia coli denominada PB12.shk (PTS- glc+ aroL-aroK- aroGfbr tktA aroB aroE), que es capaz de producir 7.05 gramos de SHK / litro, con un rendimiento de 0.282 g SHK / g glucosa, resultados que son comparables con los mejores valores reportados en la literatura. El análisis de algunos de los parámetros de cultivo en lote de esta cepa en fermentadores a una escala de 1 L en un medio mineral suplementado con 25 g/L de glucosa y 15 g/L de extracto de levadura, muestran un crecimiento exponencial durante las primeras 8 horas de fermentación alcanzando una DO600nm de 11.8, consumiendo únicamente 4 g / l glucosa. A partir de este momento mantiene la cepa un crecimiento a una velocidad menor hasta el final de la fermentación para alcanzar una DO600nm final de 17.2 (50 horas). Asociado a esta disminución en la velocidad de crecimiento después de las 8 horas de cultivo, se observa una rápida disminución en la cantidad de glucosa residual para consumirla completamente después de 32 horas. De forma interesante, aunque la producción de SHK se presenta a partir de las 2 horas de cultivo, a partir de las 8 horas y hasta el final de la fermentación se observa la mayor producción de este compuesto. Estos resultados, sugieren que durante la fase exponencial de crecimiento (primeras 8 horas de cultivo) y durante la fase de mayor producción de SHK se presenta la expresión diferencial de diversos genes involucrados en el transporte de glucosa, metabolismo central de carbono, vía de producción de SHK y diversos reguladores en esta cepa sobreproductora. El objetivo de esta propuesta es la caracterización fina de la cepa de producción obtenida respecto a su progenitora, mediante el análisis del transcriptoma por PCR en tiempo real (RT-PCR). Por otro lado, se pretende aprovechar los diferentes fondos genéticos de las cepas derivadas de cada una de las modificaciones genéticas realizadas para obtener la PB12.shk, en otras cepas utilizadas también en nuestro laboratorio para evaluar una diversidad de fondos genéticos con potencial para la sobreproducción de SHK.

Las contribuciones más relevantes de este proyecto en el contexto científico serán: 1. La caracterización transcriptómica en condiciones de fermentación de la cepa de E, coli sobreproductora de SHK PB12.shk. Este análisis permitirá la identificación de aquellos genes del metabolismo central de carbono, vía del shikimato, sistemas transportadores de glucosa y algunos genes reguladores globales, cuyos niveles de expresión se vean afectados en la cepa de producción respecto a la cepa progenitora considerada como referencia bajo condiciones de fermentación. Esta información permitirá identificar posibles puntos limitantes en la vía en esta cepa sobreproductora. 2. Generación de una diversidad de fondos genéticos de E. coli con capacidad de sobreproducción de SHK. La información que se generé de este proyecto será utilizada para la generación de dos artículos científicos internacionales en revistas arbitradas. Se pretende en una primera instancia la publicación de la caracterización transcriptómica de la cepa PB12.shk. Con relación a la utilización de diferentes fondos genéticos para obtener una diversidad de cepas sobreproductoras de SHK, se propone la publicación de los resultados obtenidos de la modificación genética de la cepa de E. coli WH33 (PTS-glc+) con los diferentes fondos genéticos desarrollados para la PB12.shk. Los resultados parciales y finales de esta investigación serán presentados en al menos un congreso nacional y un congreso internacional: 1. XIII Congreso Nacional de Biotecnología y Bioingeniería, de la Sociedad Mexicana de Biotecnología y Bioingeniería, a celebrarse en el año 2009. Lugar y fecha por definir. 2. 110th General Meeting, American Society for Microbiology. La sede y fecha de dicho evento no están definidas aún. En cuanto a la formación de recursos humanos, se pretende la participación de los siguientes alumnos: 1. El alumno de la Maestría en Ciencias Bioquímicas José Alberto Rodríguez Ruiz, quien esta actualmente cursando el 2° semestre y su proyecto de investigación plantea el uso de promotores con diferentes fuerzas de expresión para que controlen genes clave de la vía de síntesis del SHK clonados en un gen de bajo número de copias. 2. El alumno de Licenciatura en Ciencias Genómicas Aldo Barrientos García, quien realizará su tesis de licenciatura dentro de este proyecto, comenzará con la obtención de derivadas de la cepa VH33 con modificaciones secuenciales sobre los genes aroL, aroK, pykF y pykA y finalmente evaluará la capacidad de producción de SHK en sistemas de fermentación de 1 litro. 3. Se pretende la participación de una alumna de de doctorado, M. en C. Mayra Janeth Esparza Araiza., quien presentará su examen de ingreso al Posgrado en Ciencias Bioquímicas, sede Instituto de Biotecnología, UNAM. Se pretende que la alumna se integre al proyecto a partir de enero de 2009 y su proyecto consistirá en la caracterización transcriptómica de la cepa PB12.shk.