Los sistemas proteolíticos extracelulares como el de activación del plasminógeno y las metaloproteínasas de la matriz extracelular se asocian a tejidos con actividad migratoria o invasiva, tanto normales como alterados, como el trofectodermo/trofoblasto involucrado en la invasión del endometrio y tejidos cancerosos como el cáncer de mama. La invasividad de estos tejidos es regulada por el microambiente en donde la concentración de glucosa y especies reactivas de oxígeno (ERO) desempeñan un papel clave. Previamente hemos caracterizado en parte estos sistemas proteolíticos y su regulación por glucosa y ERO durante el desarrollo de embriones peri-implantacionales del ratón en cultivo, como un modelo de diferenciación del trofoblasto (Martínez-Hernández y Cols., 2011; Sánchez-Santos y Cols., en preparación), sin embargo este modelo está compuesto al menos por 3 tipos celulares. En este trabajo pretendemos completar el estudio de la acción de concentraciones altas de glucosa sobre la expresión, función y regulación de los sistemas de activación del plasminógeno y metaloproteinasas en blastocistos de ratón en cultivo y vesículas trofoblástica, además de extender el estudio en células de cáncer de mama no invasivas e invasivas. Se estudiará el efecto de diversas concentraciones de glucosa sobre la migración, invasión de células MCF-7 y MDA-MB-2312, empleando los ensayos de curación de herida e invasión de matrigel, asi como en el grado de extensión sobre un sustrato de vesículas trofoblásticas. El contenido de MMP-9, MMP2, TIMP-1, TIMP-2, plasminógeno, alfa-enolasa, uPA, uPAR, PAI-1 y sus respectivos mensajeros se evaluará por zimografía en gel, ensayo enzimático, "Western blot" y RT-PCR de tiempo real según corresponda. Se evaluará la participación de la NADPH oxidasa (Nox) y del factor nuclear NFkB (NFkB) en los cambios inducidos por alta glucosa y mediados por ERO en el desarrollo in vitro de blastocistos de ratón, mediante la evaluación de la expresión de las subunidades de membrana CYBB (gp91phox) y citoplásmica NCF2 (p67phox) de la Nox (Gomes y Cols., 2012) y NFkB, además del empleo de sus inhibidores, difenilen iodonium y apocinina para la primera y pirrolidina ditiocarbamato (PTDC), para el segundo.

El estudio de la acción de concentraciones altas de glucosa en embriones tempranos de mamíferos y células cancerosas se ha centrado fundamentalmente en su acción sobre la apoptosis y proliferación celular En los blastocistos de ratón hemos y estamos contribuyendo a la caracterización de los sistemas proteolíticos de activación del plasminógeno y MMP, en como participan en la cascada proteolítica conducente a la implantación del endometrio (Martínez-Hernández y Cols., 2011; Sánchez-Santos y Cols; en preparación). Además de la regulación del desarrollo del trofoblasto y regulación de estos sistemas proteolíticos por alta concentración de glucosa y especies reactivas de oxígeno. Adicionalmente en este trabajo contribuiremos con mas profundidad a entender los mecanismos implicados en la acción de alta concentración de glucosa, evaluando la participación en ellos del factor NFkB. Así como elucidando el papel de la alfa-enolasa en regular la cascada proteolítica iniciada en la superficie del trofoblasto. El efecto de concentraciones altas de glucosa en células de cáncer de mama y su influencia sobre la invasividad de las mismas ha sido poco estudiado, en algunos trabajos la alta glucosa no afecta hasta 4 días de cultivo el crecimiento y proliferación de células MCF-7 (Sedoris y Cols., 2007; 2010), mientras que en un trabajo reciente se le encontró un efecto apoptótico (Gupta y Tico, 2013). Por su parte la alta concentración de glucosa favorece el crecimiento de las células invasivas MDA-MB-232 (Gupta y Tikoo; 2013), en este caso debido a que las condiciones de alta glucosa condujeron a una mayor expresión de la ciclina D1, un importante regulador del ciclo celular, un aumento de la fosforilación de ERK y en desfosforilación de la proteína relacionada con la apoptosis p38 en células. En el presente trabajo contribuiremos a conocer el efecto de la alta glucosa sobre el comportamiento migratorio e invasivo de células de cáncer de mama en relación a su grado de invasividad y como estos comportamientos son modulados por medio de esttrés oxidante y la regulación de los sistemas de activación del plasminógeno y MMP. Adicionalmente, a entender la regulación de los sistemas proteolíticos por la captación de plasminógeno en la superficie de las células por alfa-enolasa y la participación del factor NFkB en la regulación transcripcional de componentes de los sistemas proteolíticos por ERO y alta glucosa. Se contribuirá a la formación de recursos humanos, Alejandrá Sánchez concluirá su tesis doctoral, Jacqueline Lara y Andrea Hernández la de licenciatura. Pretendemos que se realicen 2 estancias posdoctorales.