El poliuretano (PU) es un plástico polimérico sintético disponible comercialmente desde 1954. Debido a su amplia gama de aplicaciones, desde espumas y barnices hasta PU termoplásticos que pueden ser moldeados (suelas de tenis y facias de automóviles), su producción ha ido incrementando año con año. Tan sólo en el 2001, el consumo de PU en México fue de 69,152 toneladas de las cuales el 44% se utilizó para la producción de colchones, mientras que el resto fue utilizado en la industria automotriz, la fabricación de muebles y calzado (ANIQ, 2001). Su amplio uso ha traído como consecuencia la gran acumulación de desechos ya que sólo un bajo porcentaje del polímero puede ser reciclado exitosamente. Este material, de gran resistencia, se ha considerado como no biodegradable, sin embargo, en años recientes se ha observado que el poliéster poliuretano (PS-PU) puede ser atacado por microorganismos como hongos y bacterias. Este descubrimiento ha abierto la expectativa de que, el conocimiento de los procesos biodegradativos llevados a cabo por estos microorganismos, permitirá el desarrollo e implementación de técnicas biotecnológicas que aborden el tratamiento de desechos de PU de una manera más amable con el ambiente, más rápida y eficiente. Desde el 2004, en mi laboratorio hemos estado trabajando en el aislamiento, identificación y caracterización de bacterias capaces de crecer en PS-PU. En el 2007 publicamos un artículo (Appl. Environ. Mircobiol. 73:6214-6223) en donde demostramos que la bacteria Alicycliphilus sp., que aislamos del basurero Bordo de Xochiaca (Edo de México), es capaz de crecer en un medio mínimo de sales con un barniz comercial de PS-PU (Hydroform®) como fuente de carbono (MM-PUh). Los objetivos del trabajo que estamos proponiendo para su apoyo por PAPIIT-DGAPA (2011) son identificar y caracterizar las proteínas, y los genes que las codifican, que permiten que la bacteria Alicycliphilus sp. BQ1 sea capaz de crecer en poliuretano (PU). Por principio, como parte de la caracterización biológica, 1) queremos comparar esta bacteria con la bacteria tipo Alicycliphilus denitrificas K601 reportada como capaz de crecer en ciclohexanol (Mechichi et al., 2003), pero no sabemos si la cepa tipo es capaz de crecer en PU. En el artículo que publicamos, pudimos determinar que el ataque de la bacteria era sobre los enlaces éster del PU. A partir de entonces hemos estado trabajando en aislar e identificar la(s) esterasa(s) que son las responsables de esta capacidad. 2) Hemos determinado que existe actividad esterasa en el sobrenadante del medio de cultivo, la cual proponemos purificar e identificar. Hemos purificado una esterasa de membrana que identificamos, por espectrometría de masas en tándem, como una porina y no como una esterasa. El análisis de la secuencia de esta porina contiene firmas de la familia de esterasas GDSL, la cual presenta similitud con proteínas bacterianas autotransportadoras. 3) Es de nuestro interés demostrar que esta porina es una esterasa, para lo cual clonaremos el gen y expresaremos la proteína recombinante para purificarla, hacer ensayos enzimáticos con ella y demostrar su capacidad hidrolítica sobre enlaces éster. También realizaremos mutagénesis de los probables aminoácidos de la tríada catalítica. 4) Para todas las esterasas posiblemente involucradas en el ataque al PU, realizaremos la caracterización cinética empleando substratos con distintas longitudes de cadena así como determinaremos las temperturas y pH óptimos para su actividad. Asimismo, determinaremos los tipos de enlaces en el PU, que pueden ser atacados por las enzimas purificadas, para lo cual emplearemos substratos diseñados y sintetizados ex profeso, con grupos funcionales presentes en el PU, acoplados a moléculas de fácil identificación y análisis por cromatografía de gases y espectroscopía de infrarrojo de PUs expuestos a la bacteria. Asimismo, hemos aislado tres mutantes por transposición incapaces de crecer en MM-PUh. Parte de las secuencias identificadas como interrumpidas por el transposón las hemos amplificado y marcado radioactivamente y las hemos empleado como sondas para realizar escrutinios de una biblioteca genómica de Alicycliphilus sp. BQ1. De estos escrutinios se han aislado varias clonas positivas. 5) Se propone continuar con la caracterización de estas clonas y con la amplificación de los genes completos, con el objetivo de clonarlos en un vector adecuado, introducirlos a las mutantes y complementar las mutaciones correspondientes, esperando recuperar la capacidad de crecer en PU y con ello demostrar la participación de estos genes en el metabolismo de utilización del PU como fuente de carbono por la bacteria. 6) Debido a que sólo se pudieron obtener tres mutantes PU¯ en esta primer mutagénesis se generará otra biblioteca de mutantes empleando el mismo método de mutagénesis con el transposón Himar. Se seleccionarán mutantes PU¯, su DNA será cortado y clonado en pBS para luego seleccionar por resistencia a Gm las clonas que contengan este marcador con miras a secuenciar los fragmentos de DNA genómico adyacentes con el objetivo de identificar la secuencia que fue interrumpida por el transposón. Con este trabajo se espera poder definir las vías que la bacteria está empleando para utilizar el PU. Por último, planteamos en este proyecto 7) realizar la secuenciación del genoma de Alicycliphilus sp. BQ1 y compararlo con la secuencia del genoma de Alicycliphilus denitrificans BC o si fueras posible con el de la cepa tipo Alicycliphilus denitrificans K601, la cual tendríamos también que secuenciar, con esto determinaremos la diferencia existente entre el genoma de una especie poliuretanolítica y otra que no lo es. El desarrollo de este proyecto, para el primer año y parte del segundo, está sustentado en la participación de un técnico académico (Dr. Martín Vargas Suárez), un posdoctorante (Dr. Alejandro Hernández Morales), una estudiante de doctorado (Claudia Julieta Solís González), una estudiante de maestría (Sonia Alicia Hernández Padrón), y dos estudiantes de licenciatura (Eduardo Martínez Platón y Luz Elena Moreno González). Además contamos con la colaboración de varios académicos de distintas especialidades que apoyarán el desarrollo de este trabajo (Dr. Guillermo Mendoza, Fac. Medicina, UNAM; Dr. Miguel Ángel Cevallos Gaos, ICG, UNAM; Dr. Ignacio Regla, FES- Zaragoza, UNAM; Dra. Rosario A. Muñoz Clares, Fac. Química, UNAM) Se espera reclutar a otros estudiantes de posgrado más para el trabajo de los siguientes años. Los resultados de este trabajo se publicarán en tres artículos en revistas de circulación internacional y se presentarán avances del mismo en dos congresos nacionales y uno internacional.

Este proyecto contribuirá al conocimiento de los procesos bioquímicos y genéticos involucrados en la degradación de poliuretano por la bacteria Alicycliphilus sp. BQ1. Este conocimiento a su vez, sentará las bases para la utilización biotecnológica de esta bacteria o de los procesos bioquímicos y genéticos involucrados en la utilización del PU como fuente de carbono, lo que en un futuro, permitirá la implementación de tecnologías más eficientes de reciclado y degradación de este contaminante.