Este proyecto está encaminado a caracterizar, empleando técnicas de imagenología de Ca2+ e inmunofluorescencia cuantitativa los cambios funcionales que se presentan bajo condiciones experimentales específicas en la población de gonadotropos hipofisarios en rebanadas frescas de hipófisis (castración en rata macho, ciclo estral y ovariectomía en ratón hembra) Estos cambios reflejan una adaptación de la población de gonadotropos ante demandas funcionales específicas. Las señales de Ca2+ intracelular que dispara el GnRH en los gonadotropos se usarán para evaluar su estado funcional y la inmunofluorescencia cuantitativa en cortes histológicos se empleará para evaluar los niveles de expresión de proteínas clave que participan en esta señalización: receptores a GnRH, canales de Ca2+ dependientes del voltaje y canales de Ca2+ intracelulares (RyR e InsP3). Este proyecto comprende varias metas: i) Caracterizar los patrones de señalización por Ca2+ en respuesta a diferentes concentraciones de GnRH en la población de gonadotropos en rebanadas de hipófisis de rata macho, tanto intacta como castrada después de 15 y 45 días. ii) Estudiar las alteraciones que sufren los patrones de señalización por Ca2+ en respuesta a diferentes concentraciones de GnRH en la población de gonadotropos en rebanadas de hipófisis de ratón hembra en diferentes etapas del ciclo estral, particularmente en diestro y proestro iii) Caracterizar los cambios que se producen en los patrones de señalización por Ca2+ en respuesta a diferentes concentraciones de GnRH en la población de gonadotropos en rebanadas frescas de hipófisis de ratón hembra adulta ovariectomizada después de 15 y 45 días. iv) Mediante inmunofluorescencia cuantitativa, evaluar la expresión de receptores a GnRH, de canales de Ca2+ dependientes del voltaje y de canales intracelulares (RyR e InsP3) en gonadotropos identificados en cortes histológicos de hipófisis de animales sometidos a las condiciones experimentales descritas en los incisos i, ii y iii.

Las señales de Ca2+ que se generan en los gonadotropos en respuesta al GnRH en la rebanada de hipófisis de ratón intacto difieren de las que se observan en cultivo primario de rata. Los patrones de señalización de Ca2+ observados en las células de animales castrados en las dos condiciones (in vitro e in situ) también difieren. Estas diferencias podrían resultar de las interacciones intercelulares autócrinas y parácrinas propias del tejido glandular o bien de diferencias especie-específicas. Las implicaciones que se desprenden en uno o otro caso no son triviales. Este proyecto tiene como primer objetivo elucidar cuál de estas dos posibilidades es la correcta. Los experimentos están diseñados para proposrcionar resultados concluyentes. Se sabe que la secreción de gonadotropinas hipofisarias en respuesta al GnRH varía en función de la etapa del ciclo estral siendo mínima en diestro y máxima en el proestro tardío. Estas variaciones están moduladas por fluctuaciones en la concentración plasmática de las hormonas gonadales. Podemos suponer que, al igual que en el macho, los patrones de señalización de Ca2+ producidos por el GnRH en los gonadotropos de la hipófisis de la hembra también se modificarán en respuesta a las demandas funcionales propias del ciclo estral. Dado que en la rata y el ratón el ciclo estral es muy corto (apenas 5 días) y se tiene bien documentado como varía la secreción de gonadotropinas, esta serie de experimentos podría ser el paradigma experimental idóneo para examinar en detalle la posible correlación entre los patrones de señalización de Ca2+ y la secreción de gonadotropinas. En este momento solamente nuestro grupo tiene la experiencia (expertise) e infraestructura necesarias para abordar directamente estas importantes preguntas biológicas. Por otro lado, se sabe que los esteroides ováricos regulan la secreción de gonadotropinas y los niveles de GnRH-R en los gonadotropos hipofisarios. Puede esperarse que, como resultado de la ovariectomía y la consiguiente pérdida abrupta de la retroalimentación por hormonas gonadales en hipotalampo e hipófisis, se modifiquen drásticamente los patrones de señalización de Ca2+ intracelular de los gonadotropos en respuesta al GnRH. Es posible que estas alteraciones sean más drásticas que las que se producen en el ratón castrado. Aquí será muy importante comparar si las alteraciones que se presenten se parecen a las observadas en gonadotropos in vitro de ratas ovariectomizadas y en los gonadotropos in situ del ratón macho castrado.