El queso Cotija es un alimento artesanal que se produce a partir de leche cruda de vaca sin la adición intencional de cultivos iniciadores. Tiene un tiempo de maduración mínimo de 3 meses, después del cual presenta calidad microbiológica aceptable. En mi grupo de trabajo se han identificado distintos géneros de bacterias en muestras de quesos de la Región de Origen, ya sea por métodos tradicionales (Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp.), por métodos moleculares dependientes de PCR (Marinilactibacillus spp., Vagococcus spp., Virgibacillus spp.) y recientemente por análisis de secuenciación masiva del metagenoma bacteriano (Leuconostoc mesenteroides, Weisella paramesenteroides y Lactobacillus plantarum como dominantes). Cabe resaltar que todos los géneros encontrados con anterioridad por métodos tradicionales y moleculares dependientes de PCR se identificaron posteriormente en el análisis metagenómico, aunque algunas de las especies encontradas como dominantes en ese mismo análisis no se han encontrado anteriormente por cultivo, por lo que es muy importante renovar esfuerzos que permitan el aislamiento de dichos géneros mediante el diseño de medios de cultivo ad hoc. Los resultados obtenidos por mis estudiantes de Posgrado y Licenciatura en conjunto, han permitido contestar la pregunta de qué microorganismos se encuentran en el queso Cotija madurado, por lo que el siguiente paso sería contestar a la pregunta de ¿qué es lo que hace dicha comunidad bacteriana en el proceso de maduración? mediante el análisis funcional de su metagenoma. Por otra parte, dentro del género de Enterococcus en mi laboratorio aislamos 4 cepas de E. faecium y 3 cepas de E. faecalis y hemos observado que presentan actividad inhibitoria en contra de bacterias patógenas como Escherichia coli, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes, por lo que pudieran tener potencial para su aplicación en biotecnología de alimentos. Sin embargo, se sabe que el género Enterococcus ha emergido como una de las principales causas de infecciones nosocomiales. Su patogenicidad está atribuida a la presencia de genes de resistencia a antibióticos y de cerca de una docena de genes relacionados con virulencia. A pesar de esto, se ha observado que cepas aisladas de nichos ecológicos diferentes al nosocomial se caracterizan por tener baja incidencia de genes relacionados con factores de virulencia y baja o nula resistencia a antibióticos; además, algunos de los factores de virulencia encontrados se pueden considerar también como genes importantes en una probable función como probióticos. Aunado a lo anterior, algunas cepas de enterococos se consideran esenciales para la maduración de muchos quesos tradicionales, principalmente del sur de Europa, donde contribuyen al desarrollo de aromas y sabores por su actividad lipolítica, proteolítica y la degradación de citrato. Sin embargo, la controversia sobre el efecto negativo de su presencia en alimentos continúa siendo de gran relevancia. Por lo tanto, es importante generar mayor evidencia genómica de las cepas de Enterococcus spp. aisladas de queso Cotija, que nos ayude a entender el papel que juega esta bacteria en el alimento y contar con suficiente información genética que permita diferenciarlas de las cepas nosocomiales. Además, aunque se sabe de la importancia de Enterococcus spp. en el proceso de maduración de diversos alimentos lácteos, aún no se han dilucidado completamente los genes involucrados en dicha actividad. Lo anterior podría lograrse a través del análisis del genoma de cepas aisladas de queso para establecer genes únicos o característicos que lo diferencien de aislados de otros ambientes ecológicos y dar un panorama del potencial enzimático involucrado en la fermentación de alimentos. Paralelamente, se podría evaluar la expresión de genes que codifiquen para proteínas cuya función esté relacionada con proteólisis, lipólisis o actividad antimicrobiana con el fin de establecer la utilidad de las cepas aisladas directamente en alimentos. Una vez que se establezcan las actividades enzimáticas deseables en una cepa en particular, se propone la posibilidad de inducir mejoras en dicho microorganismo para su uso en la industria alimentaria desde el punto de vista tecnológico y de inocuidad.

El análisis funcional del metagenoma del queso Cotija será un gran paso en la descripción del potencial metabólico de la comunidad bacteriana en dicho alimento, lo que permitirá el escrutinio de genes de relevancia biotecnológica así como ampliar el entendimiento del proceso de maduración del queso. El aislamiento de microorganismos permitirá reforzar el hallazgo hecho mediante el análisis metagenómico, lo que además ampliará considerablemente la colección de cepas aisladas de este alimento para el caso en el que se proponga hacer más adelante genómica comparativa. Por ejemplo, resultaría muy interesante poder comparar la capacidad metabólica de las cepas de Leuconostoc mesenteroides que aislaran del queso contra las que se han aislado del pulque. En cuanto a la línea de investigación que se ha seguido con los enterococos, se sabe que éstos se asocian con infecciones nosocomiales (endocarditis, infecciones del tracto urinario) en pacientes inmuno-comprometidos y que pueden poseer genes de resistencia a antibióticos que son transmisibles por conjugación a otros microorganismos no patógenos. Su capacidad de distribución en diferentes ambientes, la alta interconexión entre los diferentes nichos y el bajo control de residuos en los hospitales, podría representar un riesgo para la salud del consumidor de un alimento que puede tener cepas de este género como microbiota habitual. Sin embargo, también existen evidencias de que en cepas de Enterococcus aisladas de otros nichos ecológicos diferentes al nosocomial, la presencia de genes asociados a virulencia es menos frecuente. El análisis de presencia y ausencia de genes relacionados con virulencia, hace tiempo que dejó de ser un enfoque contundente para caracterizar cepas de enterococos, de ahí que hace unos años la estrategia cambiara al análisis poblacional de dicho género con metodologías como MLST (tipificación de secuencias multilocus). Sin embargo, está técnica no siempre resulta adecuada para diferenciar cepas aisladas de diversos ambientes. Una herramienta que ha cobrado relevancia para poder resolver dicho problema es la obtención de drafts genómicos (ensamble genómico sin cerrar) y genomas cerrados con el fin de llevar a cabo análisis de genómica comparativa. El principal inconveniente es que existe poca información referente a genomas de E. faecalis y E. faecium provenientes de ambientes distintos al humano, incluyendo los casos clínicos, por lo que resulta necesario y muy interesante el análisis de cepas de un origen diferente, como lo es un alimento. Además, el incremento de secuencias genómicas de estas especies favorecería el progreso en la identificación de secuencias específicas que pudieran codificar para genes involucrados en procesos de adaptación. El desarrollo de este proyecto nos permitirá generar un panorama global de la contribución de E. faecalis y E. faecium a la fermentación de alimentos, así como los cambios genéticos que pudieran presentarse en función del nicho ecológico del que provengan. La capacidad que tienen los enterococos de sobrevivir a ambientes adversos, así como su constante presencia en distintos alimentos fermentados en general, aunado a la importante actividad bacteriolítica que presentaron las cepas aisladas del queso Cotija en particular, las colocan como excelentes candidatas para su aplicación como cultivos protectores en la elaboración de alimentos. El punto medular de la propuesta es aprovechar, por un lado, las ventajas de los enterococos aislados de alimentos y, por otro lado, mejorarlas en una cepa de la que se cuenta con abundantes antecedentes en el grupo de trabajo. Con este enfoque, el hecho de contar con información genotípica confiable, se puede aprovechar en dos sentidos, el primero de ellos añadiendo información al genoma en forma de genes codificantes para enterocinas que le confieran al microorganismo la capacidad de mejorar la actividad antibacteriana, que de por sí ya presenta; y por otro lado, en la eliminación de genes relacionados con virulencia que son no deseables en bacterias ácido lácticas iniciadoras y/o no iniciadoras en alimentos fermentados. Todo lo anterior tendrá que realizarse con un conocimiento profundo de los procesos metabólicos que se llevan a cabo en la cepa en cuestión con el fin de asegurar la viabilidad del microorganismo mejorado. La manipulación genética de la cepa bajo estudio permitirá obtener un organismo cuya información genética se conocerá a fondo, resultado del análisis genómico de la secuencia completa, con actividad antimicrobiana de amplio espectro y carente de genes asociados a virulencia, lo que la hará sumamente atractiva para su aplicación biotecnológica en la inocuidad de alimentos fermentados.