Estudios preliminares realizados para entender las características y funcionalidad del Dominio de Fijación al Almidón (DFA) de la a-amilasa de Lactobacillus amylovorus, demostraron la capacidad de este dominio para adsorberse específicamente a gránulos de almidón insoluble (Rodríguez-Sanoja, et al., 2005; Santiago, et al., 2005). La característica distintiva de este DFA es que se encuentra constituido por cinco módulos de unión a carbohidrato idénticos y en tándem, cada uno con la capacidad de adsorberse de manera independiente al almidón. El número de módulos en el DFA determina la adsorción a los gránulos con afinidades que varían hasta en un orden de magnitud (Guillén et al., 2007), por lo que las aplicaciones pueden ser amplias. Recientemente, en el laboratorio, se ha explorado el potencial de dicho DFA como un domino auxiliar para la inmovilización, transporte y/o recuperación de proteínas utilizando como soporte un sustrato abundante y económico como el almidón. Para esto, se han generado diversas fusiones con proteínas de interés biomédico o biotecnológico y el DFA en posición carboxilo terminal, demostrándose que: 1. En todos los casos las fusiones son capaces de adsorberse específicamente al almidón insoluble. 2. La adsorción de las proteínas de fusión al almidón permite su purificación por afinidad directamente sobre almidón o sobre sus análogos (beta-ciclodextrina) a partir del extracto crudo de bacteria, en algunos casos con mejores resultados que otro sistema ampliamente utilizado como el tallo de histidinas. 3. La adsorción a los gránulos del almidón aumenta la estabilidad de las proteínas fusionadas, en condiciones simuladas del tracto gastrointestinal (pH y proteasas) con respecto a la proteína libre. 4. Las proteínas fusionadas inmovilizadas en el almidón y administradas por diferentes vías son capaces de llegar a los sitios de la respuesta inmune en mucosa, induciendo una respuesta sistémica de anticuerpos (Sistema y aplicaciones incluidas en la solicitud de patente MX/a/2012/005765). Este proyecto, continuación del IN 209410 que dio origen a la patente mencionada, pretende la optimización del sistema a través de la comprensión de los mecanismos por los cuales los sustratos interactúan específicamente con el dominio de fijación, así como determinar la relación entre la unión al carbohidrato y la catálisis. Proponemos profundizar en la comprensión del funcionamiento del DFA, identificando los determinantes de afinidad y especificidad de la adsorción y estableciendo la funcionalidad de un menor número de módulos, tanto en sus aplicaciones como en la amilasa silvestre. Para lograrlo realizaremos de manera simultánea estudios de evolución dirigida, de ingeniería de proteínas y adecuaciones a los sistemas de clonación y expresión. La información así obtenida nos proporcionará las herramientas para manejar efectivamente el fenómeno de adsorción y así, complementar los estudios que ya se realizan para aplicar estos dominios en la adsorción y liberación controlada de ligandos. Además de la inherente importancia de la descripción y caracterización de una nueva estructura proteica que nos podría llevar incluso a describir un nuevo modelo de interacción carbohidrato-proteína.

Recientemente los módulos de unión a carbohidratos (MUCs) de glucósido-hidrolasas, han atraído un creciente interés; en primera instancia porque son un excelente modelo para la comprensión de las interacciones proteína-carbohidrato pero también, por su amplio potencial biotecnológico. Estudios cinéticos y de adsorción realizados en el laboratorio, nos sugieren que estos dominios nos permitirán controlar la adsorción al sustrato, abriendo un amplio esquema de posibilidades para utilizarlos en diferentes campos que requieran la inmovilización de proteínas. De hecho, hemos generado una patente con las aplicaciones (solicitud de patente MX/a/2012/005765) y otros grupos están utilizando como base la publicación donde describimos que las secuencias en tándem permiten optimizar la adsorción (Guillén, et al., 2007) para mejorar sus resultados en anclaje a membrana celular, la afinidad por diferentes receptores, etc. (Connaris, et al., 2009; Kiyohara, et al., 2009; Okano, et al., 2008). Es así que nuestra prioridad es identificar los determinantes de afinidad y especificidad de la adsorción a través de la evolución dirigida de un módulo y de establecer la funcionalidad de un menor número de módulos, tanto en sus aplicaciones como en la amilasa silvestre. La información así obtenida nos proporcionará las herramientas para diseñar experimentos que nos permitan optimizar el manejo del fenómeno de adsorción y así, complementar los estudios que ya se realizan para aplicar estos dominios en la adsorción y liberación controlada de ligandos. La propuesta además contempla la producción de AMPs en un sistema con un DFA de menor tamaño. Desde hace tiempo diversos grupos han realizado grandes esfuerzos para desarrollar estrategias para su eficiente expresión y purificación que garanticen la funcionalidad del péptido (Kitts and Weiler, 2003; Guerreiro, et al., 2008). Esperamos que al fusionarlos con nuestro dominio de fijación al almidón optimizado, se superen problemas reportados en su producción en sistemas heterólogos como son bajos niveles de expresión, pobre solubilidad, toxicidad para la célula hospedera y baja recuperación (Wei, et al. 2005). Los experimentos propuestos contemplan la optimización del sistema para el desarrollo de un kit de purificación o detección, y un sistema que pueda aplicarse en biosensores, sistemas para el transporte de moléculas como péptidos o fármacos, rastreo in vivo de fusiones inmovilizadas, entre otras. Por lo tanto, este trabajo no sólo contribuye al conocimiento de las interacciones proteína-carbohidrato y la relación estructura-función, sino que establece un avance para la aplicación tecnológica del sistema que se ha estado desarrollando con fines de aplicación tanto en la investigación como en la industria.