El estudio de la inactivación lenta de canales Kv es nuevamente un tema de frontera de la investigación Biofísica. El paradigma de la inactivación clásica tipo C, inhibida por K+, esta siendo modificado (Hoshi & Armstrong, 2013), por otro lado al comenzar este año no había aún ninguna hipótesis sobre el mecanismo de inactivación facilitada por K+ (no tipo C) que exhiben varios Kv, como Shab. Nuestro laboratorio recientemente describió, por primera vez, las propiedades de la inactivación de Shab y propuso una hipótesis del mecanismo de inactivación facilitada por K+ (Arias-Olguin et al, 2013; Carrillo et al, 2013). El presente proyecto estudiara la validez de nuestra hipótesis (ver sección de HIPOTESIS), y se tratará si es el caso de hacerla más precisa (para lo cual es indispensable estudiar la inactivación de Shab con más detalle) o bien se modificará. En concreto en este proyecto: (a) estudiaremos como varia la inactivación (OI/CI) con la [K+] tanto intra como extracelular (en nuestro trabajo previo solo consideramos una [K+]). (b) Determinaremos si hay una correlación entre el grado de inactivación y la permeabilidad relativa del poro, para así determinar si hay un cambio en la configuración del llamado filtro de selectividad al darse la inactivación. (c) Estudiaremos el estado de la entrada extracelular del poro en el estado no-inactivado vs. inactivado utilizando como reportero al ión Ba++ cuyo radio es igual al del K+, y el Cd++ el cual podría en principio ser coordinado de forma diferencial en los canales inactivados por las cisteínas presentes a la entrada del poro (2 residuos en la secuencia primaria por arriba del filtro de selectividad). (d) Determinaremos si, además de la quinidina, otros bloqueadores de la cavidad central (TEA y sus derivados mas hidrofobicos) inhiben la inactivación de Shab, lo cual reforzaría nuestra hipótesis de que es alrededor de este sitio donde ocurre el cambio conformacional que inactiva los canales. (e) Lo anterior lo haremos en el Shab silvestre y en dos mutantes de posiciones que juegan un papel relevante en la inactivación más estudiada que es la C de Shaker (Objetivos).

En este proyecto haremos aportaciones relevantes, de frontera, en el campo de la biofísica de canales iónicos que permitirán un mejor entendimiento de la dinámica K+-dependiente del poro de los canales de K+ y en particular del mecanismo de inactivación lenta de los Kv. El mecanismo de la inactivación lenta de canales Kv es nuevamente uno de los temas de mayor controversia e interés de la investigación Biofísica. Lo anterior se debe a que por un lado el paradigma de la inactivación clásica tipo C, inhibida por K+, que fue vigente por ~20 años esta siendo modificado (Hoshi & Armstrong, 2013), y por otro lado al comenzar este año no había aún ninguna hipótesis sobre el mecanismo de inactivación facilitada por K+ (no tipo C) que exhiben varios Kv, como Shab. Nuestro laboratorio recientemente formulo la primera hipótesis sobre esta forma de inactivación facilitada por K+ (Arias-Olguin et al, 2013; Carrillo et al, 2013). Reconocemos que nuestra hipótesis necesita ser formulada con mayor precisión, pero ello exige necesariamente que se profundice el estudio de la inactivación de Shab, lo cual se hará con este proyecto. Este estudio no solo ahondara nuestro conocimiento de esta forma de inactivación, sino que también aumentara nuestra comprensión de la dinámica general K+-dependiente del poro de los canales de K+, lo cual constituye el principal interés de nuestro laboratorio. El gating de inactivación de canales Kv y su modulación dinámica por K+ juega un papel crítico en la dinámica de las respuestas eléctricas de las células, por lo que entender estos fenómenos es fundamental para la neurofisiología y en general para la fisiología celular.