ANÁLISIS DE LA FUNCIÓN DE LA TIMIDINA CINASA EN LOS EVENTOS DE REPARACIÓN DEL DNA EN PLANTAS._x000D_ _x000D_ _x000D_ Como fotótrofos obligados, un tipo de estrés ambiental al cual están expuestas todas las plantas en distintos grados es el componente ultravioleta (UV) de la radiación solar. El daño inducido por la radiación UV a las células epidérmicas de la planta es inevitable. La radiación UV-B tiene muchos efectos directos e indirectos en plantas, incluyendo daño a DNA, proteínas y membranas, alteraciones en transcripción y fotosíntesis, cambios en crecimiento, desarrollo y morfología, e inestabilidad genética. Sin embargo, el principal daño al DNA causado por exposición a luz UV-B es la formación de dímeros entre pirimidinas adyacentes, (fotoproductos UV que consisten en dímeros ciclobutano de pirimidinas y dímeros 6-4PPs).. La formación de estos dímeros puede bloquear la transcripción en células e inhiben la replicación de DNA causando una detención en el avance de la horquilla de replicación. Asimismo, la presencia de dímeros de pirimidina constituyen daños premutagénicos._x000D_ Las plantas han evolucionado distintos mecanismos para reparar el DNA dañado, y uno de ellos es la escición de nucleótidos (NER), en el cual se reconoce la cadena dañada y elimina un oligonucleótido (24-32 pb) que contiene el producto dañado y rellena el hueco mediante síntesis de DNA. Este mecanismo depende del aporte de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) que funcionan como precursores monoméricos del DNA. Esta dependencia se ha observado porque mutantes de Arabidopsis thaliana deficientes en niveles de la ribonucleótido reductasa son más susceptibles a agentes genotóxicos que las plantas silvestres._x000D_ Otra vía de aporte de dNTPs es la vía de salvamento de nucleótidos que reutilizan los nucleósidos y bases libres, producto de la degradación del DNA, el RNA y de nucleótidos (Sugiura y Takeda, 2000). Este reciclaje permite mantener el aporte y los niveles de nucleótidos a un costo energético menor que la biosíntesis de novo. _x000D_ La timidina cinasa es una enzima clave en la vía de salvamento de nucleótidos de timina, ya que regula el aporte de éstos para la síntesis de ADN. En plantas se conoce poco sobre las características de esta enzima, sus genes y sobre todo su función. En el genoma de Arabidopsis thaliana se han identificado dos genes que se expresan y que codifican TKs con un 53% de identidad a nivel de secuencia de aminoácidos. Los genes (AT3G07800-TK1a y AT5G23070-TK1b) se encuentran en los cromosomas 3 y 5 respectivamente. La enzima TK1b tiene una extensión de 30 aminoácidos en el extremo amino que no está presente en la enzima TK1a y que podría funcionar como señal de localización hacia el cloroplasto. _x000D_ Para ambos genes se han identificado varias líneas de inserción de T-DNA, y dos de éstas se han analizado en el laboratorio después de demostrar la presencia de la inserción y el estado homocigoto de estas plantas. El análisis de estas plantas mutantes durante su crecimiento y desarrollo no ha permitido dilucidar la función de estas enzimas puesto que ninguna de estas plantas muestra un fenotipo visible y que sea distinto al de las plantas silvestres. _x000D_ Sin embargo, nuestros datos preliminares muestran que una de estas líneas mutantes es más susceptible a radiación UV que la línea silvestre lo que nos permite formular la hipótesis de que el aporte de dTTP mediado por la vía de salvamento de nucleótidos en el que la TK tiene un papel fundamental, es esencial para los procesos de reparación del DNA sobre la función de la TK en plantas._x000D_ _x000D_ Para poder responder esta hipótesis se plantea el este proyecto con las siguientes actividades:_x000D_ _x000D_ 1. Obtener otras líneas mutantes homocigotas de los genes de TK y comparar su fenotipo con el de plantas silvestres Col-0._x000D_ 2. Obtener una línea silenciada de ambos genes TK mediante microRNAs artificiales._x000D_ 3. Hacer una caracterización fenotípica de las mutantes, de las líneas silenciadas y las líneas de sobreexpresión._x000D_ 4. Evaluar la suscetpibilidad relativa a los agentes genotóxicos (Luz UV y mitomicina C) de estas líneas mutantes, silenciadas y silvestres. _x000D_ 5. Hacer un análisis de los promotores de los genes TK1a y TK1b durante el desarrollo y crecimiento de A. thaliana y su posible activación en respuesta a estrés genotóxico._x000D_ 6. Hacer estudios para determinar la localización subcelular de las proteínas AtTK1a y AtTK1b ya que la estructura primaria de AtTK1b predice un péptido señal de tránsito al cloroplasto._x000D_ 7. Realizar un análisis de los transcritos AtTK1a y AtTK1b y otros genes asociados a procesos de reparación de DNA._x000D_ _x000D_ Este estudio permitirá obtener información básica sobre la estructura de los genes TK en plantas y en particular sobre su función en un metabolismo fundamental para la sobrevivencia de las plantas en cualquier medio ambiente._x000D_ _x000D_ En el proyecto DGAPA-PAPIIT-225405 se realizó una caracterización bioquímica y de expresión de la timidina cinasa de maíz (1 tesis de Maestría; 1 tesis de licenciatura; 1 manuscrito en preparación). Este trabajo permitió desarrollar las herramientas para el estudio de esta enzima como es la medición de la actividad enzimática, la generación de un anticuerpo y la expresión del gen. Sin embargo, el modelo de maíz tiene limitantes para hacer un estudio funcional al no haber mutantes y el hecho de que no es fácil su transformación. Es por esto que se propone el estudio en el modelo de Arabidopsis thaliana. _x000D_ _x000D_ Se formarán recursos humanos a nivel licenciatura (4 tesis) y una de maestría con estudiantes que se lleguen a incorporar al proyecto._x000D_ _x000D_ Se cuenta con la colaboración del Dr. José Luis Reyes Taboada, Investigador del Instituto de Biotecnología y quien es un experto al haber desarrollado vectores y otras herramientas para el silenciamiento génico mediado por microRNAs._x000D_ _x000D_ Se cuenta con la participación de la M.C. Manuela Nájera Martínez quien tiene amplia experiencia en Biología Molecular de Plantas para la construcción de secuencias quiméricas, clonación y transformación._x000D_ _x000D_ Durante el primer año se contempla la participación de dos estudiantes de licenciatura y la incorporación en los primeros meses del proyecto de uno o dos mas._x000D_

Este proyecto aportará información básica sobre la expresión y función de los genes de timidina cinasa durante el desarrollo vegetal y su papel en el aporte de nucleótidos para la reparación del daño al DNA causado por luz ultravioleta._x000D_ Una vez demostrada esta función se podrá evaluar alguna aplicación biotecnológica potencial en la sobreexpresión de esta enzima en plantas, como se ha postulado para otras enzimas involucradas en la reparación del DNA._x000D_ _x000D_ Otra contribución relevante del proyecto será en la formación de recursos humanos para la elaboración de tesis de licenciatura de las carreras de QFB y QA de la Facultad de Química.