Uno de los enfoques contemporáneos más exitosos en el estudio de las funciones de las proteínas está basado en la correlación entre la información obtenida mediante métodos estructurales, termodinámicos y cinéticos. El abordaje fisicoquímico integral busca generar los llamados "paisajes conformacionales", esto es, la colección de mecanismos que conectan a las diversas estructuras visitadas por la proteína. El objetivo actual de nuestro grupo es generar estos paisajes para describir las excursiones conformacionales que permiten y definen las funciones y disfunciones de las proteínas, esto es, el plegamiento y la asociación de las cadenas polipeptídicas; así como la unión de ligandos y la catálisis. El protocolo que se presenta en esta convocatoria, es la continuación y profundización del proyecto en curso PAPIIT IN-206510 "Caracterización del paisaje energético/conformacional en el plegamiento de proteínas" apoyado por tres años en la convocatoria PAPIIT 2009. Descritas como entes moleculares, las transiciones conformacionales de las proteínas están estipuladas por la estructura y la energía de los estados involucrados; en este sentido, el paisaje conformacional de las proteínas está determinado por las leyes de la fisicoquímica. La variación histórica en la secuencia de aminoácidos, es decir, la evolución, es el otro gran factor que moldea este paisaje. El objetivo a largo plazo de nuestro grupo es agregar la dimensión evolutiva a la caracterización fisicoquímica del paisaje conformacional de las proteínas. El proyecto presentado a continuación plantea preguntas específicas utilizando tres proteínas modelo: 1) Para explorar la relación entre el plegamiento y la catálisis, estudiamos a la triosafosfato isomerasa o "TIM". Esta enzima sólo es funcional como oligómero y está formada por 2 o 4 subunidades de ca. 250 residuos, que adoptan un plegamiento de barril (ß/a)8. A lo largo de la evolución, la estructura tridimensional de la TIM está conservada, en contraste, el mecanismo de plegamiento es diverso. Mediante la descripción del paisaje conformacional de la TIM de diversas especies y de TIMs ancestrales, pretendemos entender cómo se refleja la diversidad evolutiva en el plegamiento, la asociación y la catálisis. 2) Para explorar la relación entre el plegamiento funcional y el disfuncional, estudiamos a la proteína modelo "6aJL2". Este sándwich ß es un dominio Ig formado por 111 residuos, que contiene la secuencia que codifica para la cadena ligera de las inmunoglobulinas provenientes de la línea germinal ? 6a. Las proteínas de esta familia son frecuentemente encontradas en una enfermedad debida al plegamiento anómalo de proteínas, la amiloidosis AL. Mediante la descripción del paisaje conformacional de 6aJL2, buscamos entender cómo la secuencia y las propiedades del medio, modulan la relación entre el plegamiento y la formación de fibras amiloides. 3) Para investigar la relación entre el plegamiento y la unión de ligandos, caracterizamos a la proteína "LAO". Miembro de la familia de proteínas periplásmicas de unión (PBPs), esta cadena de 238 residuos se pliega formando dos lóbulos a/ß, los cuales adoptan una conformación "abierta" en ausencia de ligandos y una "cerrada" al unir con afinidad nanomolar a los aminoácidos básicos Lisina, Arginina y Ornitina. Al describir el paisaje conformacional de LAO y de las PBPs de otras especies, buscamos entender cómo se manifiesta la variación evolutiva en los cambios conformacionales involucrados en el plegamiento al estado nativo y aquellos que acompañan la unión del ligando.

TIM, 6aJL2 y LAO : Los modelos experimentales a estudiar. Las tres secciones del proyecto tienen en común la caracterización del paisaje conformacional de las proteínas. El nivel de profundidad que hemos alcanzado en cada sistema es heterogéneo. Las contribuciones centrales de las tres secciones del proyecto son: 1)El paisaje conformacional de la Triosafosfato isomerasa (TIM): Plegamiento, asociación y catálisis. No sabemos cómo la evolución moldea la estabilidad y propiedades catalíticas de las enzimas. Tomando como andamiaje una estructura conservada, ¿Qué tan diverso pueden ser el mecanismo de plegamiento; el número y tipo de intermediarios; las barreras energéticas que los separan y su estabilidad relativa? A la fecha se ha descrito el comportamiento de varias TIMs, sin embargo, no es posible hacer una correlación extensa ya que los estudios publicados utilizan diferentes perturbantes y/o monitores conformacionales. Es nuestro interés caracterizar TIMs representativas de la variedad filogenética de nuestro planeta y TIMs ancestrales utilizando como perturbantes a la temperatura y la urea, para de esta manera tener una base completa de datos fisicoquímicos y termodinámicos sobre la evolución del plegamiento y la catálisis en esta enzima. ¿En qué momento de la evolución se volvió la TIM un oligómero catalíticamente perfecto? 2)El paisaje conformacional de 6aJL2: Plegamiento funcional y disfuncional. Al estudiar durante el proyecto en curso, las propiedades cinéticas del plegamiento 6aJL2 a mayor resolución temporal, encontramos que aún en escalas temporales cortas el proceso no es de dos estados, la presencia de dos fases en el replegamiento nos ha conducido a determinar el papel de las prolinas en el proceso así como a analizar la pertinencia de mecanismos secuenciales o paralelos. Buscaremos determinar el paisaje conformacional que conduce al plegamiento y condensarlo con el que describe la formación de fibras amiloides. ¿De qué manera se modifican estos paisajes al variar la secuencia? ¿Cómo cambian las rutas, velocidades y energías al modificar las condiciones del medio? 3)El paisaje conformacional de la proteína LAO: Plegamiento y unión de ligandos. A pesar de su abundancia, el plegamiento de las proteínas multidominio ha sido poco estudiado. Debido a su tamaño (238 residuos), esta proteína de dos dominios es un excelente modelo para profundizar en el plegamiento de proteínas complejas. La unión de ligandos con alta afinidad va acompañada de un gran cambio conformacional, nos interesa determinar de que manera estos dos eventos están acoplados.