En reportes previos nuestro grupo demostró que la protoxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis es un potente inmunógeno y adyuvante mucosal y sistémico. Asimismo, en modelos murinos encontramos que tanto el pretratamiento con la proteína sola, como la coadministración de protoxina Cry1Ac con lisados de algunos parasitos, puede incrementar la protección en contra las infecciones parasitarias (Naegleria, Malaria y cisticercosis). El presente proyecto se enfoca a abordar dos aspectos de las propiedades inmunológicas de la proteína Cry1Ac de Bacillus thuringiensis que requieren estudios de investigación básica para contribuir a definir su utilidad como adyuvante vacunal. - Primer aspecto, en relación al mecanismo de acción inmunomoduladora o inmunoestimuladora, los resultados de nuestros estudios previos indican que Cry1Ac induce activación de macrófagos y linfocitos, además aunque en células de vertebrado no se ha descrito la existencia de un receptor de las proteínas Cry nuestros resultados sugieren su posible existencia. Sin embargo se requiere caracterizar con más detalle el mecanismo por el que la protoxina Cry1Ac ejerce sus efectos inmunomoduladores, es necesario determinar en poblaciones aisladas de macrófagos y linfocitos, si la proteína induce activación de forma directa sobre linfocitos, caracterizar la cinética de activación en linfocitos y macrófagos, determinar si la unión de la proteína se relaciona con el estado de activación, realizar ensayos de inmunoprecipitación para identificar posibles receptores, corroborar la función de los posibles receptores determinando si se inhibe la unión y la activación al inhibir su expresión usando RNAs de interferencia.a la proteína inhibir la actividad de la proteína en una línea celular de macrófagos. - Por otra parte, el segundo aspecto que abordaremos es el siguiente: aunque las proteínas bioinsecticidas Cry1Ac son consideradas no toxicas para vertebrados, no se han evaluado si puede provocar posibles efectos inmunotoxicológicos derivados de su administración oral. Los efectos inmunológicos mucosales descritos por nuestro grupo, muestran algunas características similares (inducción de respuestas predominantemente tipo Th2), a las descritas por adyuvantes mucosales como la tóxina de cólera que es considerada alergénica y se usa como adyuvante en varios modelos para estudiar la alergia alimentaria. Aunado a esto, el hecho de existen plantas transgénicas que expresan proteínas Cry que son ya usadas para consumo humano, hacen inminente evaluar a nivel intestinal la alergenicidad potencial o posibles alteraciones inmunitarias (inflamación, cambios en poblaciones celulares intestinales, etc) que pudieran derivar de la administración oral de esta proteína, o en todo caso apoyar su bioseguridad, estudio que además de requerirse para definir la utilidad de Cry1Ac como adyuvante vacunal, contribuirá a la comprensión de aspectos no descritos de la alergia intestinal. - En síntesis el objetivo global es contribuir a definir la utilidad de la protoxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis como adyuvante vacunal enfocando de forma conjunta nuestros esfuerzos a resolver dos aspectos fundamentales no descritos: Mecanismo de acción inmunomoduladora ( identificación de receptores en macrófagos) y bioseguridad de su aplicación oral o potencial alergénico o inflamatorio intestinal. La meta es publicar 4 artículos, graduar 4 estudiantes de licenciatura, uno de maestría y uno de doctorado.

El proyecto contribuirá a definir la utilidad de la proteína Cry1Ac como adyuvante vacunal enfocándonos a estudiar dos aspectos de las propiedades inmunológicas la protoxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis: i) Caracterizar el mecanismo inmunomodulador, para contribuir a comprender las bases celulares buscando identificar posibles receptores de esta proteína en células de mamífero y ii) determinar si la proteína Cry1Ac es alergénica o puede provocar respuestas alérgicas o inflamatorias intestinales cuando es administrada por la vía oral. i) En el proyecto IN226610 iniciamos la búsqueda de posibles receptores de la toxina y protoxina Cry1Ac en linfocitos macrófagos. Primero ensayamos en leucocitos de bazo totales, posteriormente en macrófagos aislados y recientemente en linfocitos T CD4, T CD8 y B aislados y en la línea de macrófago J774. Encontramos que las proteínas se unen a macrófagos, pero solo a una proporción de linfocitos B y linfocitos T CD4 y CD8. Tanto la protoxina como la toxina Cry1Ac activan porcentajes similares de los diferentes tipos celulares, pero difieren en la forma en que activan y se unen especialmente a las subpoblaciones de linfocitos T. En ensayos de blot ligando en leucocitos se unen de forma distintas, la unión de la toxina parece depender de carbohidratos. Mediante microscopía confocal encontramos que ambas proteínas se unen a la superficie de macrófagos y linfocitos. (Tesis de Medina 2011). Hasta ahora solo hemos realizado la caracterización de los efectos in vitro e in vivo de la protoxina Cry1Ac en la activación de macrófagos de raton midiendo citocinas proinflamatorias, y moléculas coestimuladoras B7-1 y B7-2. (Moreno-Fierros et al enviado 2012) Para complementar la caracterización de los efectos inmunológicos de la toxina y la protoxina Cry1Ac evaluaremos marcadores adicionales como CD40, MHC-II, ICOS-L, CD11b, así como un perfil más amplio de citocinas Th17, T reguladoras y Th2, también realizaremos ensayos temporales y curvas dosis respuesta para optimizar las condiciones experimentales para realizar los ensayos funcionales para evaluar receptores potenciales. En resumen en poblaciones aisladas de macrófagos y linfocitos T CD4, CD8 y B determinaremos lo siguiente: i) si la proteína toxina y protoxina Cry1Ac inducen activación de forma directa sobre linfocitos T y B, ii) caracterizar la cinética de activación en linfocitos y macrófagos (citocinas, marcadores de activación), iii) realizar ensayos de blot ligando e inmunoprecipitación en lisados y fraciones de membrana de macrófagos, linfocitos T y B, iv) realizar análisis por espectrometría de masas para identificar posibles receptores, v) iniciar estudios encaminados a corroborar la función de los posibles receptores determinando si se inhibe la unión y la activación al inhibir su expresión mediante la técnica de RNA de interferencia en una línea celular de macrófagos. ii) Iniciamos también la evaluacion de la bioseguridad o potencial alergénico de la aplicación intranasal y oral de la toxina y protoxina Cry1Ac cuando son coadministrada con ovoalbúmina en sistema inmunitario pulmonar e intestinal, pero aún no hemos completado dicha caracterización. (tesis Meneses 2010) Los resultados apoyan su adyuvanticidad pero la protoxina Cry1Ac no induce cambios histopatológicos asociados con una reacción alérgica como incremento de IgE y granulocitos en pulmones como los controles positivos (OVA+ toxina de cólera y OVA + ALOH). Para evaluar el potencial alergénico de Cry1Ac por vía oral primeramente tuvimos que desarrollar un modelo murino de alergia intestinal. Existen limitaciones en la mayoría de los modelos animales disponibles para evaluar la alergenicidad alimentaria, que limitan su validez Berin MC, Mayer L. La mayoría de estudios se limitan a la evaluación de los niveles de IgE en suero, Bruijnzeel-Koomen 95 Algunos evalúan la antigenicidad por vía parenteral, o la respuesta sistémica de anticuerpos IgE inducida por la administración oral o intraperitoneal Dearman 01. En algunos modelos la sensibilización del control negativo es oral pero se comparan contra la sensibilización vía i.p. con OVA ALOH y retado por vía oral Knippels 99 o intranasal. Otros incluyen sensibilización y reto vía oral pero evalúan solo la respuesta sistémica Dearman 01, o la respuesta sistémica y en mucosa pulmonar pero no la intestinal Adel-Patient K 10. Los pocos que evalúan el intestino solo realizan evaluación histológica, y citocinas en ganglio mesentérico Perrier 10. El modelo más apropiado debe de incluir un esquema sensibilizaciones y retos por vía oral y evaluación de la respuesta en la mucosa intestinal, ya que la sensibilización por otras rutas como la i.p. no refleja los mecanismos de patogenicidad que llevan a la alergia alimentaria Knippels 04. En dos reportes recientes se desarrollaron modelos en ratón Balb/c para inducir alergia y evaluar claramente alergia intestinal hacia OVA que incluyen un esquema de sensibilización semanal similar por via oral con OVA con 10 ug de CT, seguido de un reto oral con OVA sola. La dosis de OVA fue muy diferente OVA de 20 mg Perrier 10 y otro de 100 ug Ganeshan 09 para sensibilizar (durante 7 y 9 semanas respectivamente), mientras que el reto fue de 100 mg y 5 mg respectivamente. Para determinar si via oral Cry1Ac favorece el desarrollo de alergia intestinal hacia un antígeno coadministrado, y/o si administradas sola la protoxina y toxina Cry1Ac tienen algún potencial alergénico, nosotros hemos estandarizado un modelo de alergia intestinal hacia OVA en el que también tanto las sensibilizaciones como retos de los animales se realizan por vía oral para semejar más el proceso como se establece la alergia intestinal. El modelo de alergia se basa en parte en el esquema descrito Ganeshan 08 y consiste de 8 de sensiblilzaciones semanales orales con 50 ug de OVA o usando 5 mg de OVA coadministrando junto al adyuvante toxina de cólera 10 ug, seguido del reto con la proteína sola 100 ug y 10 mg sacrificando una hora después del ultimo reto. La caracterización que planeamos realizar contempla caracterización de células intestinales (Reséndiz 05, Verdin 09) un aspecto importante que no se analiza en los modelos de alergia intestinal descritos. El estudio está en proceso pero debe completarse y consistirá de: i) el análisis de las alteraciones histopatológicos en la mucosa intestinal, ii) análisis respuestas de anticuerpos específicas hacia OVA y hacia la Cry de diferentes isotipos IgE, IgG1, IgG2a, IgA, IgM en sueros y lavados intestinales, iii) análisis de citocinas IL4, IL-13, IFNg, IL10 en suero y análisis de expresión de mRNA de citocinas en tejido linfoide intestinal; iv) análisis por citometría de flujo para determinar las modificaciones en proporciones de linfocitos y de poblaciones de granulocitos en los compartimientos intestinales (intraepitelial y lámina propia). Los resultados no permiten establecer si la administración oral de Cry1Ac favorece o no el desarrollo de respuestas alérgicas, ya que solo provoca algunos cambios como el grupo OVA+CT como incremento en linfocitos B IgE.