Algunas plantas han desarrollado la capacidad de contender con el estrés osmótico causado por sequía, suelos hipersalinos o frío mediante la síntesis y acumulación del osmoprotector más eficiente conocido: la glicina betaína (GB). Un objetivo biotecnológico, aún no alcanzado, es el convertir en plantas acumuladoras de GB a aquellas plantas de interés agrícola que no son naturalmente acumuladoras. De aquí el interés de estudiar la ruta de biosíntesis de GB que consta sólo de dos pasos a partir de colina catalizados por la colina monooxigenasa (CMO), que oxida colina a betaína aldehído (BAL), y por la betaína aldehído deshidrogenasa (BADH) que oxida BAL a GB. Dentro de la superfamilia de las aldehído deshidrogenasas (ALDHs), las BADHs de plantas pertenecen a la familia ALDH10, enzimas cuyos sustratos preferidos son aldehídos con un grupo amino primario o con un grupo amonio cuaternario (trimetilamonio). Sólo algunas de las ALDH10 pueden usar a BAL como sustrato, lo que recientemente demostramos que se debe a que poseen un residuo pequeño que permite que el voluminoso grupo de trimetilamonio de la BAL se acomode en el sitio activo. Las plantas acumuladoras de GB, como espinaca, poseen la enzima capaz de oxidar BAL, mientras que las no acumuladoras sólo poseen ALDH10s que oxidan a los otros aminoaldehídos. Con respecto a las CMO, éstas son monoxigenasas exclusivas de plantas cuyas propiedades cinéticas y estructurales han sido muy poco estudiadas. Todas las plantas poseen esta enzima, pero se ha propuesto, aunque no demostrado, que no es activa en las plantas no acumuladoras de GB. En este proyecto, tomando como modelo a las enzimas de espinaca (SoBADH y SoCMO) y mediante el uso de técnicas de cinética enzimática de pre- y estado estacionario, de calorimetría, de mutagénesis sitio-dirigida y de cristalografía y difracción por rayos X, llevaremos a cabo el estudio de las propiedades estructurales que definen la especificidad por BAL de las BADH y por colina de las CMO. Esto, junto con el análisis de la filogenia y evolución de estas dos enzimas, nos permitirá avanzar en la comprensión del proceso por el cual algunas plantas adquirieron la capacidad de sintetizar GB, lo que les ha dado una ventaja indudable al poder contender con el estrés osmótico mucho más eficientemente que aquellas que no han desarrollado esta capacidad. Concretamente pretendemos: 1) Investigar si la especificidad por los ?-aminoaldehídos sustratos de las ALDH10 está determinada por la unión o la catálisis, para lo cual determinaremos las constantes de disociación de estos aldehídos de la enzima silvestres y mutantes seleccionadas. 2) Determinar la estructura tridimensional de la SoBADH con ABAL u otro ?-aminoaldehído unido al sitio activo, tanto en forma productiva como "inactivante". 3) Determinar la estructura tridimensional de la SoCMO sin y con su sustrato unido. 4) Identificar y mutar los residuos de aminoácidos de la SoCMO posiblemente involucrados en la unión de la colina. 5) Obtener la filogenia de las dos enzimas, explorar si co-evolucionaron y analizar los posibles procesos evolutivos que tuvieron lugar. Los resultados de estos estudios, además de su indudable valor dentro de un contexto de ciencia básica por su novedad e impacto en el conocimiento de estas enzimas, pueden tener importantes aplicaciones biotecnológicas en el futuro para incrementar la resistencia de cultivos susceptibles a sequía o suelos hipersalinos, que son los dos problemas más serios que enfrenta la agricultura a nivel mundial, y en particular en México.

El estrés osmótico causado por sequía, suelos hipersalinos o frío constituye la principal limitante para la producción agrícola a nivel mundial. Una de las respuestas metabólicas de las plantas a este estrés es la síntesis de compuestos pequeños, polares y neutros, que pueden acumularse en el interior de la célula hasta concentraciones elevadas. Estos compuestos se llaman solutos compatibles u osmoprotectores porque no sólo evitan la pérdida del agua intracelular sino que al mismo tiempo protegen macromoléculas, como proteínas y ácidos nucleicos, y estructuras celulares, como membranas, ante estas condiciones ambientales adversas. En plantas angiospermas la GB es el osmoprotector más ampliamente distribuido y es además el más eficiente de los osmoprotectores conocidos. La biosíntesis de GB en aquellas plantas que lo utilizan como osmoprotector, como es el caso de espinaca, se lleva a cabo en los cloroplastos a partir de colina en dos reacciones consecutivas de oxidación: la primera catalizada por la colina monooxigenasa (CMO), que oxida el grupo alcohol de la colina al grupo aldehído de la betaína aldehído, y la segunda y última por la betaína aldehído deshidrogenasa (BADH), que oxida el grupo aldehído al grupo ácido de la glicina betaína. Ambas enzimas, por tanto, juegan un papel muy relevante en la respuesta de las plantas al estrés osmótico, lo que se manifiesta en que su expresión se incrementa notablemente cuando se somete a la planta a estrés osmótico. No todas las plantas, sin embargo, poseen la capacidad de acumular GB en respuesta a este estrés, por lo que un reto biotecnológico es el convertir a plantas no acumuladoras de alto interés agrícola, como arroz o trigo, en plantas acumuladoras mediante ingeniería genética. Para alcanzar este objetivo biotecnológico se requieren estudios básicos sobre la estructura y función de las enzimas involucradas en la ruta biosintética de glicina betaína. La presente propuesta contribuirá con nuevos conocimientos sobre la función y estructura de las ALDH10 y CMO de plantas, lo que será de gran utilidad para cualquier posible futura manipulación biotecnológica de estas enzimas. Concretamente planteamos en este proyecto el estudio desde el punto de vista funcional, estructural y evolutivo de la especificidad por el sustrato (colina y betaína aldehído) de las enzimas de espinaca: SoBADH y SoCMO. Para profundizar en el conocimiento de los factores que determinan la especificidad por BAL de las ALDH10 proponemos determinar las constantes de disociación de los posibles aldehídos sustratos de la SoBADH, mediante tecnologías que no se han aplicado a este tipo de enzimas (la cinética de estado pre-estacionario y la calorimetría isotérmica, así como la estructura tridimensional de esta enzima con el sustrato aldehído unido, lo que definirá su forma o formas de unión. Igualmente, nos proponemos determinar la estructura tridimensional de la SoCMO, que sería la primera estructura de esta familia de enzimas, tanto en su forma libre como unida a su sustrato la colina. Esta estructura nos permitirá conocer con certeza los residuos de aminoácidos involucrados en la unión de la colina, los cuales serán mutados para confirmar su papel. Aportaremos además datos cinéticos de la SoCMO, tanto en estado estacionario como de una reacción monociclo, que se complementarán con los datos estructurales para conocer las relaciones estructura-función de estas enzimas, no sólo en cuanto a su especificidad por el sustrato sino también en cuanto a su mecanismo de reacción. Por otra parte, los estudios de filogenia y el análisis evolutivo que planteamos llevar a cabo permitirán inferir cómo han adquirido algunas plantas la capacidad de sintetizar glicina betaína, y abordar una pregunta clásica en biología evolutiva: qué tan estricto tiene que ser el acoplamiento entre las entidades interactuantes (las dos enzimas que participan en esta ruta biosintética, en este caso) para que se pueda dar la coevolución. En resumen, con este proyecto, queremos avanzar con los estudios de estructura-función que hemos venido realizando con la BADH de espinaca (SoBADH), aportando ahora datos originales sobre su especificidad por el sustrato, e iniciar estudios de este tipo con la SoCMO, lo que abrirá una nueva línea de investigación en el grupo de trabajo de la responsable del proyecto. Y poner a nuestros resultados en un contexto evolutivo, con el fin de poder extrapolarlos a las familias a las que las enzimas que estudiaremos pertenecen. El conocimiento que se adquiera tendrá, además de su posible interés biotecnológico, un indudable valor dentro de un contexto de ciencia básica, por su novedad e impacto en la enzimología de este importante grupo de enzimas de plantas. Durante el desarrollo del proyecto se llevará a cabo el entrenamiento posdoctoral de dos doctores y se realizarán dos tesis de licenciatura y posiblemente una de posgrado. Esperamos además publicar al menos tres artículos en revistas internacionales de prestigio con arbitraje estricto y presentar los resultados en congresos o reuniones académicas para su difusión y discusión directa con las comunidades científicas nacional e internacional.