La exposición de las poblaciones humanas a diferentes agentes mutágenos, cancerígenos y teratógenos ha generado un considerable interés en el estudio de los componentes de la dieta, principalmente los derivados de las plantas por sus propiedades antioxidantes. En estudios epidemiológicos y experimentales se ha mostrado que algunas plantas comestibles o sus componentes (fitoquímicos) presentan actividad como antimutágenos y tienen efectos protectores en la carcinogénesis humana, por lo que a la dieta se le ha reconocido como un factor importante en la modulación de enfermedades relacionadas con el daño al ADN. En el presente proyecto se estudiarán los efectos in vivo de compuestos fitoquímicos (clorofilina, extractos fenólicos y ácido ascórbico) sobre la inducción de daño al ADN y apoptosis en ratones tratados con compuestos de cromo (Cr), vanadio (V) y talio (Tl), y se establecerá la relación del daño al ADN y la apoptosis con el estrés oxidante, para lo cual se emplearán técnicas de espectrofluorometría mediante la determinación de los niveles del glutatión (GSH) y las Especies Reactivas de Oxígeno (ERO´s). Los niveles de GSH y ERO´s se evaluarán en células de médula ósea de ratones tratados con los compuestos metálicos, los fitoquímicos o ambos, las determinaciones se harán mediante los métodos de la 2´,7´diclorofluorescein-diacetato (DCFH-DA) y del monoclorobimano (mBCl) empleando un espectrofluorometro EPOCH-TM. Las evaluaciones del daño al ADN inducido por los compuestos metálicos se realizará mediante la cinética de las frecuencias de micronúcleos (MN) en eritrocitos de sangre periférica de muestras tomadas durante 3 días (cada 12 horas) después de la administración de los tratamientos. Los efectos protectores del daño al ADN de los compuestos fitoquímicos se realizarán con esta mismo ensayo (MN). La evaluación de la apoptosis se realizará mediante el análisis de células de médula ósea (cambios morfológicos nucleares por condensación y fragmentación de la cromatina). Antes de realizar las evaluaciones se harán pruebas de viabilidad celular empleando la prueba colorimétrica de tinción con tetrazolio (MTT). Se espera que los compuestos de Cr (VI) y de V (V) al ser capaces de atravesar la membrana celular se reduzcan y generen ERO´s que afecten los niveles antioxidantes (en este caso de GSH) y por lo tanto se induzca tanto daño al ADN como apoptosis celular, las cuales se determinen mediante el incremento de la frecuencia de MN y el incremento en la fragmentación y condensación de la cromatina. Por otra parte, dadas las propiedades antimutágenas de la CFL y las oxidantes de los extractos polifenólicos y del ácido ascórbico, se espera que su administración in vivo previa a los tratamientos con los compuestos metálicos en el ratón, reduzcan las frecuencias de MN y la fragmentación y condensación de la cromatina. Con los resultados del presente proyecto se espera contribuir con la generación de información básica para establecer los fundamentos científicos en el planteamiento de estrategias, para el tratamiento y prevención de enfermedades crónico-degenerativas que están relacionadas con el daño al ADN y el estrés oxidante. Esto de acuerdo a las necesidades de salud pública nacionales e internacionales dado que las poblaciones humanas estamos expuestas a diversos agentes que pueden alterar la integridad del ADN y por lo tanto repercutir en nuestra salud.

En el presente proyecto se espera estudiar y analizar los efectos in vivo de compuestos fitoquímicos con propiedades antioxidantes, sobre el daño al ADN y la apoptosis inducidos por compuestos metálicos. Con este estudio también se espera establecer la relación del daño al ADN y la apoptosis con el estrés oxidante, así como, contribuir con la generación de información básica para establecer los fundamentos científicos en el planteamiento de estrategias, para el tratamiento y prevención de enfermedades crónico-degenerativas que están relacionadas con el daño al ADN y el estrés oxidante. Esto de acuerdo a las necesidades de salud pública nacionales e internacionales por estar las poblaciones humanas expuestas a diversos agentes que pueden alterar la integridad del ADN y por lo tanto repercutir en la salud. En los últimos años se ha incrementado la búsqueda y el estudio de sustancias con propiedades protectoras del daño al ADN. De todos los estudios realizados, se ha encontrado un mayor potencial de protección con los componentes fitoquímicos incluidos en la dieta debido a su capacidad antioxidante. En nuestro grupo de investigación estamos interesados en contribuir con los estudios de los efectos protectores de daño al ADN in vivo de compuestos fitoquímicos incluidos en la dieta humana, como parte de nuestro programa de investigación para evaluar sustancias quimiopreventivas y quimioprotectoras, así como continuar con las evaluaciones del daño al ADN producido por metales (estudio de los mecanismos moleculares)._x000D_ En estudios previamente desarrollados en nuestro grupo de trabajo, hemos observado que sustancias como las sales de sodio y cobre de la clorofila (clorofilina CFL) protegen del daño al ADN in vivo causado por radiación gamma (Morales-Ramírez y García-Rodríguez 1994) y por sales metálicas de cromo [Cr (VI)] (García-Rodríguez et al. 2000, 2001, 2006), llegando a observar que la vía de administración de la CFL juega un papel importante en sus mecanismos de protección (García-Rodríguez et al. 2003). Sin embargo, con estos estudios aún no hemos podido identificar el mecanismo de protección de la CFL sobre el daño genotóxico inducido por los compuestos de Cr (VI). Se ha planteado que los probables mecanismos antimutagénicos de la CFL pueden ser mediante la inhibición de la función enzimática del sistema de activación metabólica (citocromo P-450), interacción directa con el mutágeno, formación de compuestos moleculares no covalentes, por captura de radicales libres y disminuyendo la absorción de los mutágenos en el intestino e incremento de su eliminación por orina y bilis y (García-Rodríguez y Altamirano-Lozano 2006). Por lo que con los resultados y su análisis en este estudio esperamos esclarecer el mecanismo de protección de la CFL al determinar los niveles de GSH y ERO´s en ratones tratados con CFL y compuestos metálicos inductores de ERO´s y RL, empleando el método de la 2´,7´diclorofluorescein-diacetato (DCFH-DA) y del monoclorobimano (mBCl). _x000D_ Por otra parte, en nuestro grupo de trabajo hemos iniciado otros estudios empleando fitoquímicos identificados claramente como antioxidantes tales como el ácido ascórbico (ac. Asc.), el índole-3-carbinol, el alfa-tocoferol, los beta-carotenos, la capsaicina, la antraquinona y algunos flavonoides como la quercetina y la rutina, con la finalidad de comparar su potencial antigenotóxico sobre compuestos de Cr (VI) (García-Rodríguez et al., 2010a, 2010b, 2010c, 2011). De todos estos fitoquímicos antioxidantes observamos un mayor potencial de protección de daño al ADN con el ac. Asc. y con los flavonoides (quercetina y rutina), por lo que con este estudio esperamos también contribuir en establecer la relación del estrés oxidante inducido por compuestos metálicos in vivo y su relación con la protección del daño al ADN de fitoquímicos antioxidantes, para lo cual determinaremos los niveles de GSH y ERO´s. Por otra parte, también se espera generar información respecto a la apoptosis y su relación con la administración de antioxidantes y compuestos metálicos, para lo cual se tratarán ratones con ac. Asc. y con un extracto de antioxidantes polifenólicos extraído del té verde, empleando el método de la DCFH-DA y del mBCl. _x000D_ La posibilidad de emplear sustancias que pudieran contrarrestar los efectos dañinos de agentes genotóxicos y carcinógenos abre un campo de investigación importante, por lo que, considerando los resultados y datos que se tienen hasta el momento del estudio de agentes antimutágenos y anticancerígenos es posible indagar los mecanismos de protección, y con ello plantear los mecanismos de inducción de daño, contribuyendo así en la generación de alternativas en la prevención y tratamiento de enfermedades crónico-degenerativas relacionadas con el daño al ADN y estrés oxidante. En la actualidad se han empezado a realizar estudios preclínicos y clínicos empleando fitoquímicos como la CFL por su actividad antimutágena, El “National Institute of Environmental Health Science”, USA, respaldó una investigación en la República de China, en la cual se está administrando CFL en personas voluntarias expuestas de manera natural en su dieta a concentraciones elevadas de aflatoxina B1. Las primeras observaciones de este estudio, indican que, en las personas tratadas con CFL se reduce al menos el 20 % la inducción de daño al ADN y el riesgo de desarrollar hepatocarcinomas (Egner et al. 2003). Debido a que este tipo de estudios son complejos y tardados se están realizando pruebas preclínicas con líneas celulares tumorales, para conocer los mecanismos por los que la CFL suprime el cáncer (Díaz et al. 2003), por lo que se ha propuesto también ampliar los estudios para poder plantear los procesos por los cuales más conveniente administrar un agente antimutágeno para obtener mayor eficacia. Estos estudios, además de profundizar en los mecanismos de protección y modulación de daño, generan alternativas para contrarrestar los efectos de los agentes inductores del daño, considerando que el uso de antimutágenos y anticarcinógenos en los humanos, puede ser uno de los procedimientos más efectivos para prevenir el cáncer y las enfermedades genéticas. Cabe señalar, que no se debe descartar la posibilidad de que el daño puede ser incrementado por el agente protector o modulador (Lee y Park 2003, Surh y Ferguson 2003, Ferguson et al. 2004, García-Rodríguez y Altamirano-Lozano 2007). _x000D_ En contra parte, el estudio de sustancias inductoras de daño mutagénico, cancerígeno también es de gran importancia, debido al incremento en el riesgo de exposición de las poblaciones humanas a diversos agentes inductores de daño genético. Se ha mostrado que los compuestos de Cr (VI) son capaces de atravesar la membrana celular in vivo y generar daño al ADN mediante la generación de ERO´s y RL (O´Brien et al. 2003). En nuestro grupo de trabajo también hemos estudiado los compuestos de V y hemos observado que inducen daño genotóxico in vivo mediante la inducción de aberraciones cromosómicas e intercambio de cromátidas hermanas y rupturas de hebra sencilla (Roldán y Altamirano 1990, Rojas et al. 1996, Altamirano-Lozano et al. 1998, 1999) y dado que se ha propuesto que los compuestos de V son reducido por el GSH o por el ac. Asc. y causar daño mediante estrés oxidante (Rehder 2003), en el presente trabajo también se espera contribuir en ampliar la información respecto este mecanismo de inducción de daño al ADN de los compuestos de V (V). Para comparar los mecanismos de inducción de daño al ADN se seleccionó también el Tl, ya que aunque se ha observado que compuestos como el sulfato de talio (Tl2SO4) tienen efectos tóxicos en humanos, hay pocos estudios respecto a sus efectos genotóxicos, mecanismos de inducción de daño al ADN y apoptosis pese a que la Agencia de Protección al Ambiente de los Estados Unidos lo ha incluido como contaminante ambiental y de alto riesgo para la salud._x000D_ Cabe señalar que los ensayos para la determinación de ERO´s y GSH serán inplementadas en nuestro laboratorio in vivo, ya que solo se han reportado in vitro, para lo cual se establecerán colaboraciones con otros grupos de investigación (Facultad de Medicina, IIB