Uno de los mayores problemas actuales de las neurociencias es entender los mecanismos celulares y moleculares de la neurodegeneración, conocimiento sin el cual no será posible diseñar estrategias terapéuticas eficaces. Este proyecto contribuirá al avance de este conocimiento, en especial en cuanto a la regulación o modulación de la excitabilidad neuronal y su relación con el daño o muerte neuronal y el papel que en éste juegan el metabolismo energético mitocondrial y los procesos oxidativos, así como la apoptosis, en tres modelos experimentales de excitotoxicidad in vivo que hemos desarrollado en el laboratorio, dos en la médula espinal y uno en el hipocampo. El primer modelo de muerte de motoneuronas espinales es agudo, por perfusión de AMPA, el agonista por excelencia de los receptores de glutamato tipo AMPA, por microdiálisis; el segundo es crónico, por infusión lenta de AMPA con minibombas osmóticas durante varios días. El modelo del hipocampo es utilizando 4-aminopiridina (4-AP), un bloqueador de los canales de potasio que estimula la liberación de glutamato desde las terminales sinápticas y por lo tanto produce excitotocicidad por el glutamato endógeno. En este sentido importa mencionar que nuestro laboratorio ha generado por primera vez en la literatura científica precisamente estos tres modelos. Debido a la probable participación del fenómeno de excitotoxicidad en estos mecanismos, las relaciones entre la hiperexcitabilidad neuronal, generadora de epilepsia, y la neurodegeneración, constituye un reto adicional. Asimismo, es muy relevante conocer los posibles mecanismos de neuroprotección por agentes endógenos, que involucran posiblemente diversos factores neurotróficos como el VEGF. Igualmente importante es conocer la muy probable participación de las especies reactivas de oxígeno (ROS) en el daño neuronal, por lo que se requiere conocer como se producen estos compuestos en la excitotoxicidad. Experimentos recientes demuestran que no sólo las mitocondrias, sino la NADPH oxidasa, puede ser la fuente de los ROS. Otros factores que deben conocerse son las moléculas protectoras del metabolismo general y de la apoptosis, recientemente descubiertas, como las deacetilasas de proteínas (sirtuinas). _x000D_
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Es poco lo que se sabe del posible papel de las neuronas inhibidoras en la médula espinal, en la modulación de la excitotoxicidad generada por sobrefuncionamiento de la transmisión excitadora glutamatérgica. Estas neuronas son principalmente GABAérgicas en el hipocampo y tanto GABAérgicas como glicinérgicas en la médula espinal. Esto se estudiará tanto en el hipocampo como en nuestros dos modelos experimentales de la degeneración de las motoneuronas._x000D_
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Por otra parte, la mayor parte del desarrollo de fármacos dirigidos a proteger contra la neurodegeneración ha sido sobre los receptores ionotrópicos de glutamato, lo cual no ha resultado satisfactorio debido a que los antagonistas de estos receptores inhiben la transmisión sináptica excitadora rápida y por ello tienen numerosos efectos secundarios. Este problema ha generado la búsqueda de otros posibles agentes neuroprotectores, como los que actúan sobre los mGluR, que ofrecen un nuevo camino en el tratamiento de la epilepsia, con la ventaja de que hasta ahora no se han descrito efectos secundarios graves. De aquí la importancia por conocer los mecanismos moleculares que regulan la señalización de estos receptores en el hipocampo in vivo. _x000D_
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El proyecto aquí propuesto pretende aportar nuevos conocimientos sobre varios de estos mecanismos en los tres modelos experimentales señalados, el agudo y el crónico de degeneración de las motoneuronas espinales, y el de la 4-AP en el hipocampo, en la rata. Los procedimientos experimentales que se emplearán han sido ya establecidos en el laboratorio, e incluyen técnicas electroencefalográficas, microdiálisis, determinación de aminoácidos por HPLC, histología, inmunocitoquímica, western blots, microscopía electrónica y microscopía confocal. Se usará una batería de drogas con efectos inhibidores o bloqueadores específicos para analizar cada parte del proyecto. El objetivo general del proyecto es aportar datos sobre los mecanismos de muerte neuronal, en relación con la hiperexcitabilidad neuronal, la apoptosis, el metabolismo energético mitocondrial, la fuente de ROS y la transmisión sináptica inhibidora, mediante experimentos in vivo, en la médula espinal y en el hipocampo de la rata. _x000D_

DOS NOTAS IMPORTANTES: _x000D_
1. POR CONSIDERAR QUE ES MAS CLARA LA EXPOSICION, EN ESTA SECCION SE HAN CONJUNTADO LOS ANTECEDENTES DEL PROYECTO Y SU CONTRIBUCION. POR ESTO, ESTA SECCION ES REALMENTE EL PROTOCOLO DE INVESTIGACION COMPLETO, EXCEPTO LA METODOLOGIA, QUE SE INCLUYE EN LA SECCION DISEÑO EXPERIMENTAL. LOS OBJETIVOS E HIPOTESIS TAMBIEN SE INCLUYEN EN ESTA SECCION, AUNQUE SE PRECISAN (LOS OBJETIVOS) EL LA SECCION CORRESPONDIENTE. _x000D_
2.REITERO QUE LA LISTA COMPLETA DE TODAS LAS REFERENCIS CITADAS A LO LARGO DE CADA SECCION APARECE AL FINAL DE LA SECCION DISEÑO EXPERIMENTAL-METODOLOGIA._x000D_
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ANTECEDENTES - CONTRIBUCION DEL PROYECTO_x000D_
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El proyecto que ahora se presenta es en buena medida la continuación del proyecto IN209807 que me fue apoyado por el PAPIIT para ejercerse de 2007 a 2009. Por esta razón, los antecedentes más relevantes para el proyecto que ahora se presenta son los resultados obtenidos en los últimos tres años en nuestro laboratorio. Conviene por eso iniciar con un resumen de logros en dicho período:_x000D_
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1. Se publicaron nueve trabajos en revistas internacionales, los cuales se enlistan más abajo; Además, al momento de envío de este protocolo hay un trabajo en evaluación en una prestigiada revista, y tres manuscritos en preparación. En el conjunto de estos trabajos se informa sobre los resultados obtenidos en el proyecto._x000D_
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También es importante señalar que durante el período 2007-2009 se graduaron tres estudiantes, uno de licenciatura, uno de maestría y uno de doctorado, con tesis dirigidas por el responsable del proyecto. Además, la tesis de maestría de una estudiante está ya en manos del jurado correspondiente y se graduará próximamente._x000D_
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Los trabajos publicados en el período 2007-julio de 2009 son los siguientes:_x000D_
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J.C. Corona, R. Tapia. 2007. Ca2+-permeable AMPA receptors and intracellular Ca2+ determine motoneuron vulnerability in rat spinal cord in vivo. Neuropharmacology 52, 1219-1228._x000D_
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L.B. Tovar-y-Romo, R. Tapia. 2007. Excitotoxicity as a mechanism of motoneuron death in amyotrophic lateral sclerosis. In Neurochemistry of Neuronal Death (L. Massieu, C. Arias, J. Morán, eds.). Research Signpost, Kerala, India, pp. 223-234._x000D_
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L.B. Tovar-y-Romo, A. Zepeda, R. Tapia. 2007. Vascular endothelial growth factor prevents paralysis and motoneuron death in a rat model of excitotoxic spinal cord neurodegeneration. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 66, 913-922._x000D_
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J.C. Corona, L.B. Tovar-y-Romo, R. Tapia. 2007. Glutamate excitotoxicity and therapeutic targets for amyotrophic lateral sclerosis. Expert Opin. Ther. Targets 11, 1415-1428._x000D_
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L. Núñez-Jaramillo, B. Jiménez, N. Ramírez-Munguía, I. Delint-Ramírez, C, Luna-Illades, R. Tapia, F. Bermúdez-Rattoni. 2008. Taste novelty induces intracellular redistribution of NR2A and NR2B subunits of NMDA receptor in the insular cortex. Brain Res. 1215, 116-122._x000D_
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J.C. Corona, R. Tapia. 2008. Calpain inhibition protects spinal motoneurons from the excitotoxic effects of AMPA in vivo. Neurochem. Res. 33, 1428-1434._x000D_
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G.X. Ayala, R. Tapia. 2008. HSP70 expression protects against hippocampal neurodegeneration induced by endogenous glutamate in vivo. Neuropharmacology 55, 1383-1390._x000D_
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L.B. Tovar-y-Romo, L.D. Santa-Cruz, A. Zepeda, R. Tapia. 2009. Chronic elevation of extracellular glutamate due to transport blockade is innocuous for spinal motoneurons in vivo. Neurochem. Int. 54, 186-191._x000D_
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L.B. Tovar-y-Romo, L.D. Santa-Cruz, R. Tapia. 2009. Experimental models for the study of neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Molecular Neurodegeneration 4: 31 doi:10.1186/1750-1326-4-31 (13 pp.)._x000D_
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Cabe mencionar que los tres trabajos firmados por Juan Carlos Corona como primer autor constituyeron la parte central de su tesis doctoral. Juan Carlos se doctoró en agosto de 2007 y en la actualidad se encuentra en una estancia posdoctoral en la Universidad Autónoma de Madrid. Por otra parte, los cuatro trabajos firmados de Luis Tovar y Romo como primer autor serán la parte central de su tesis doctoral; Luis se graduará durante el próximo semestre escolar._x000D_
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Neurodegeneración_x000D_
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Las enfermedades neurodegenerativas constituyen uno de los más graves problemas de salud, debido a que sus efectos son devastadores sobre las funciones neurológicas y mentales, a que no se conocen las causas ni los mecanismos neurobiológicos que podrían explicar la muerte de las neuronas, y a que no existe tratamiento alguno, ni preventivo ni curativo, para estas enfermedades. Es por esto de gran relevancia desarrollar modelos experimentales que permitan explorar los mecanismos de neurodegeneración y conocer las alteraciones bioquímicas y moleculares que la determinan. _x000D_
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En los últimos años se ha obtenido información que permite postular ciertos mecanismos que participan en la muerte neuronal. De manera general, estos mecanismos incluyen la apoptosis y la necrosis, aunque cada vez es más claro que no existe una clara frontera entre uno y otro mecanismo, pues depende de los factores causales y temporales en el proceso de neurodegeneración. Un factor común de estos mecanismos parece ser una deficiencia en el metabolismo oxidativo mitocondrial, que particularmente en el sistema nerviosos central (SNC) puede ser causado por el mecanismo de excitotoxicidad en las sinapsis glutamatérgicas como consecuencia de la sobreactivación de los distintos tipos de receptores al glutamato (Tapia, 1996, 1998; Tapia et al., 1999; Tapia, 1996; Tapia et al., 1999a; Cleveland y Rothstein, 2001; Corona et al., 2007). En efecto, los receptores al glutamato de tipo ionotrópico son permeables al Ca2+, de modo que la incrementarse la entrada la de este catión aumenta su concentración en el citoplasma lo suficiente para rebasar la capacidad de los sistemas amortiguadores intracelulares, y en consecuencia se activan enzimas líticas que coadyuvan a la destrucción membranal, de los ácidos nucleicos, y de otras proteínas. A esto se agrega la deficiente eliminación de los radicales libres o especies reactivas de oxígeno (ROS), ya que el gran poder oxidante de estos compuestos causa la oxidación de lípidos y de proteínas y el daño de las estructuras membranales, incluyendo las motocondrias y la membrana plasmática (Choi, 1988; Beal et al., 1993; Coyle y Puttfarcken, 1993; Olanow, 1993; Siesjö, 1994; Tapia, 1996, 1998; Tapia et al., 1999a). Los receptores ionotrópicos del glutamato son el tipo N-acetil-D-aspartato (NMDA) genéricamente llamdo tipo no-NMDA, que responde al ácido kaínico (KA) o al -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropionato (AMPA) (receptores AMPA-kainato). _x000D_
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Además de los receptores ionotrópicos al glutamato, se conocen varias clases de receptores metabotrópicos (mGluR), los cuales no forman canales en la membrana sino que están acoplados a proteínas G y la síntesis de segundos mensajeros intracelulares. Los mGluR de los subtipos I y II son predominantemente postsinápticos, mientras que los del subtipo III son autorreceptores presinápticos y parecen jugar un papel importante en la regulación de la liberación del glutamato (Conn y Pin, 1997; Cartmell y Schoepp, 2000; Pinheiro y Mulle, 2008)._x000D_
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Esclerosis lateral amiotrófica (ALS) y mecanismos de muerte de las motoneuronas espinales _x000D_
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La ALS es una enfermedad crónica neurodegenerativa que se caracteriza por la pérdida selectiva y progresiva de las motoneuronas en la médula espinal, el tallo cerebral y la corteza motora. Se clasifica en dos formas, la esporádica (SALS) a la que pertenecen aproximadamente el 90% de los casos y la familiar (FALS), que comprende al 10% restante y tiene un patrón de herencia autosómico dominante; no hay diferencias patológicas o sintomáticas entre ambas formas y se ha postulado que los mecanismos de neurodegeneración en ambos tipos son similares (Cleveland y Rothstein, 2001; Corona et al., 2007; Tovar-y-Romo et al., 2007, 2009a). _x000D_
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Se ha planteado que la muerte neuronal en la ALS se debe a la excitotoxicidad producida por una transmisión glutamatérgica excesiva. Esta hipótesis se fundamenta en que algunos pacientes con SALS, aproximadamente 40% de acuerdo con los estudios más extensos (Shaw et al., 1995; Spreaux-Varoquaux et al., 2002), t