La síntesis de más del 90% del ATP celular se realiza en la mitocondria. La F1F0-ATP sintasa (complejo V) es la encargada de traducir la energía almacenada en el gradiente electroquímico de protones en ATP a partir de ADP y fosfato. Esta enzima es considerada un nanomotor, donde el estator está constituido por el dominio catalítico hidrofílico F1-estator compuesto por las subunidades solubles alfa y beta, y por el dominio F0-estator-membranal formado por las subunidades ATP6(a), ATP8(A6L), i/j, e y ATP20(g) además del F0-estator-tallo periférico, constituido por las subunidades ATP4/b, OSCP, h(F6), d y f,. Por otra parte, el rotor está constituido por el dominio F1-rotor formado por las subunidades gama, delta y épsilon, y el F0-rotor compuesto por las subunidades ATP9/c. No obstante la importancia que tiene la síntesis de ATP, la F1F0-ATP sintasa desempeña además otro papel, no menos importante, el de plegar a la membrana interna mitocondrial en crestas. Para desempeñar este novedoso papel, la F1F0-ATP sintasa se asocia en oligómeros, siendo el dímero el más estudiado. Como reflejo de la gran diversidad de organismos, cada reino ha desarrollado diferentes estrategias para formar el dímero del complejo V: por ejemplo, en Bos taurus el dímero parece estar estabilizado por la IF1, proteína reguladora de la actividad catalítica de esta enzima; las algas verdes como Chlamydomonas reinhartii y Polytomella sp, cuentan con una familia de proteínas denominadas ASA; en las levaduras como Saccharomyces cerevisiae las subunidades dimerizantes son la g y la e. Sin embargo, la actividad catalítica del dímero aislado ha sido poco estudiada, y los resultados publicados son cualitativos. En nuestro laboratorio hemos abordado el estudio del dímero de la F1F0-ATP sintasa de las mitocondrias del basidiomiceto Ustilago maydis, un hongo patógeno del maíz. Actualmente hemos solubilizado con digitonina al dímero (V2) y al monómero (V1) del complejo V y los hemos purificado por medio de un gradiente de sacarosa. Esto permitió determinar, mediante la espectrometría de masas (MS/MS), que las subunidades asociadas exclusivamente al V2 son la sub-e y la sub-g, las cuales han sido descritas como las dimerizantes. Aunado a esto, hemos iniciado la caracterización cinética del V2 y V1; los resultados sugieren que el V2 es más activo que el V1, y más sensible a la oligomicina. Estas observaciones indican que las dos formas del complejo V son estructural y catalíticamente diferentes. A partir de estos novedosos resultados, decidimos determinar la repercusión de la eliminación de las subunidades dimerizantes (sub-e y sub-g) en la oligomerización y la actividad cinética de la F1F0-ATPsintasa de Ustilago maydis, así como su papel en la formación de crestas y en el estado bioenergético mitocondrial. En nuestro laboratorio tenemos la experiencia y el equipo para realizar el análisis bioquímico y bioenergético de las mitocondrias, purificar al V2 y V1 y determinar su comportamiento cinético, sin embargo, para la construcción de las mutantes (delta-g y delta-e) se entabló la colaboración con el Dr. Michael Feldbrügge del Instituto de Microbiología de la Universidad Heinrich-Heine de Düsseldorf, Alemania, quien es un experto en la biología molecular de U. maydis. Actualmente contamos con los plásmidos knock-out de las subunidades g y e, y en breve iniciaremos en nuestro laboratorio la transformación de la sepa silvestre de U. maydis. Nuestros resultados repercutirán en una mejor comprensión de la actividad catalítica y papel del dímero en la fisiología mitocondrial.

Dentro del estudio de la arquitectura mitocondrial, se ha demostrado que el dímero del complejo V (V2) tiene un papel importante en la formación de las crestas de la membrana interna. Asimismo, se sabe que cada reino biológico ha conseguido estructurar al V2 empleando diferentes subunidades: la IF1 en los mamíferos como Bos taurus, las subunidades ASA en las algas como Chlamidomonas rehiharti, y las subunidades e y g en los hongos como Saccharomices cerevisiae y Ustilago maydis. Todos estos dímeros comparten la cualidad de plegar a la membrana interna mitocondrial en crestas, las cuales son el sub-compartimento mitocondrial asociado al consumo de oxígeno, la generación del gradiente electroquímico de protones y la síntesis de ATP. La importancia de las crestas mitocondriales hizo que el estudio de la estructura del V2 cobrara gran relevancia. Así pues, se conoce con cierto detalle su estructura tridimensional, la magnitud del ángulo con el que pliega a la membrana interna, y se ha propuesto la manera en que los V2 se pueden arreglar en la membrana. Sin embargo la actividad cinética del V2 ha sido poco estudiada y los resultados publicados son solo cualitativos. En este sentido, en nuestro laboratorio hemos solubilizado a los complejos mitocondriales de U. maydis y aislamos al V2 y V1 por medio de un gradiente de sacarosa; esto nos permite tener a ambas formas estructurales en solución y determinar espectrofotométricamente sus parámetros cinéticos. Esto significará darle al V2 características cinéticas propias al contrastarlas con el V1, y ofrecer una hipótesis funcional para el V2 además de su papel en la arquitectura mitocondrial. Esta es la primera vez que se empleará este enfoque en el análisis del comportamiento cinético del V2. Así mismo se pretende determinar la Ki para la oligomicina del V2 y V1, e incrementar así el conocimiento cinético de ambas formas estructurales. Debido a que la formación del homo-dímero del complejo V en U. maydis está relacionado a las subunidades e y g, su deleción genética será de gran utilidad para ampliar el conocimiento del papel del dímero en la arquitectura mitocondrial, además de abrir la posibilidad de explorar los parámetros bioenergéticos de las mitocondrias de las cepas mutantes, con la finalidad de determinar su estado fisiológico. Aunado a esto, a partir de la construcción de las cepas mutantes se realizará el aislamiento del V2 y V1 para caracterizarlos cinéticamente, con lo que se determinará la repercusión de la interacción de los monómeros, mediada por las subunidades dimerizantes, en el dímero durante la catálisis. Adicionalmente, se analizará la arquitectura mitocondrial de las cepas mutantes por medio de microscopía de transmisión electrónica; con esto se determinará el efecto de la deleción de las subunidades dimerizantes en la formación de las crestas mitocondriales. Así pues, el proyecto permitirá comprobar que las subunidades e y g son las dimerizantes del complejo V en U. maydis, determinar la repercusión de estas subunidades en la actividad cinética del V2, analizar el papel de la modificación del V2 en la bioenergética y en la arquitectura mitocondrial. Parte del proyecto propuesto es el trabajo experimental de María de las Mercedes Esparza Perusquía, estudiante del Programa de Doctorado en Ciencias Biológicas, de la UNAM.