Las bombas de calcio del retículo sarco(endo)plásmico (SERCAs) tienen como función controlar los niveles de las concentraciones de calcio libre en el citosol de todas las células. Las SERCAs son responsables de mantener la velocidad de contracción y la relajación de músculo cardiaco y esquelético. Además, las bombas SERCA tienen un papel crucial en varios mecanismos de señalización intracelular. Se ha reportado la expresión de las isoformas SERCA2 y SERCA3 de forma tejido específica en células cancerosas, sin embargo, se desconocen los mecanismos moleculares responsables de su expresión durante la carcinogénesis. En este proyecto proponemos estudiar los mecanismos transcripcionales y epigenéticos que modulan la expresión de los genes ATP2A2 y ATP2A3 en líneas celulares tumorales humanas de carcinoma gástrico, de colon y de mama. Se cuantificarán los niveles de ARNm por RT-PCR de tiempo real, y por Western blot los niveles de proteína para las isoformas de SERCA2 y SERCA3 en las líneas celulares. Se cuantificará la [Ca2+]i para establecer una correlación con los niveles de SERCA2 y SERCA3 en las células. Se analizará la participación de los elementos de unión a factores de transcripción de la familia de Sp y KLF en la transcripción del gen ATP2A3 en células tumorales. Se estudiará el papel del nivel de metilación del ADN en las islas CpG presentes en la región reguladora-5´ de los genes ATP2A2 y ATP2A3 humanos. Se usará 5-azacitidina para hipo-metilar al ADN y se analizarán cambios en los niveles de expresión de ARNm y proteína para SERCA2 y SERCA3. También se evaluará el grado de metilación de la región reguladora del los genes ATP2A2 y ATP2A3 por la técnica de modificación química de citosinas usando bisulfito y PCR tiempo real para observar cambios en la Tm de los productos de ADN. Además, usando inhibidores de desacetilasas de histonas (HDACs) butirato y tricostatina-A se evaluará su participación en la expresión de ambos genes en las líneas celulares antes mencionadas. Otro de los objetivos de este proyecto es estudiar el nivel de expresión de ARNm y proteína para SERCA2 y SERCA3 en los tumores que se ha descrito desarrollan los ratones haplo-insuficientes para el gen Atp2a2+/-. También se analizará el nivel de metilación de la región reguladora-5´ de los genes murinos Atp2a2 y Atp2a3. El modelo murino heterocigoto Atp2a2+/- resulta particularmente útil para estudiar el papel que juega la expresión disminuida de SERCA2, y por tanto de alteración en la [Ca2+]i durante la tumorigénesis de varios tipos de cáncer. Los resultados de este proyecto contribuirán al conocimiento de la participación de mecanismos transcripcionales y epigenéticos que regulan la expresión de las bombas SERCA2 y SERCA3 en el diagnóstico, patogénesis y tratamiento del cáncer.

A pesar de los avances recientes de la investigación en cáncer, aún se desconocen con precisión cuales son los mecanismos moleculares responsables que participan en la expresión de genes que regulan la homeostasis de calcio en células tumorales. En años recientes se ha reportado la importancia de la regulación de las concentraciones intracelulares de calcio por las bombas del calcio SERCA2 y SERCA3 en los procesos de diferenciación celular y en la patogénesis del cáncer. La movilización del calcio del retículo endoplásmico (RE) en el citosol es un componente dominante de varias redes que señalizan y controlan el crecimiento, la diferenciación, o la apoptosis de la células normales y tumorales. Las ATPasas que transportan calcio al RE desempeñan un papel importante en estos fenómenos. Se ha reportado que la expresión de SERCA2 y/o SERCA3 está reducida o perdida perceptiblemente en carcinomas de colon en comparación con las células epiteliales de colon normal, que expresan estas enzimas en un alto nivel (Papp et al., 2004). Debido a que la homeostasis de calcio del RE puede también influenciar la diferenciación de la célula, se propone que la modulación de la expresión de las varias isoformas de SERCA, particularmente la inducción de la expresión de las bombas del tipo SERCA3, que son parte integral del programa de la diferenciación de algunos tipos del cáncer. El contenido de SERCA2 y SERCA3 del RE puede constituir un nuevo marcador por el cual las características de la homeostasis de calcio de las células cancerosas cambian. La interrelación entre la homeostasis de calcio del RE y la diferenciación de la célula puede tener algunas implicaciones para la mejor comprensión de los defectos en la señalización intracelular implicados en la adquisición y el mantenimiento del fenotipo celular. Distintos grupos de investigación han detectado disminución o incluso pérdida de la expresión de la proteína SERCA3 en diferentes tipos de cáncer, estableciendo una correlación inversa entre su abundancia y el grado de displasia del tumor. El grupo de Gelebart y colaboradores identificó un incremento en la expresión de la proteína SERCA3 en células de cáncer gástrico y de colon inducidas a diferenciación in vitro, mediante la adición de butirato de sodio e inducida por confluencia celular. Utilizando ambos modelos, nuestro grupo identificó que la inducción de la expresión de SERCA3 ocurre también a nivel de ARNm. El incremento en la expresión del ARNm de SERCA3 después de la diferenciación fue de 40 a 50 veces comparada con las células tumorales sin tratamiento. El marcado aumento en la expresión del ARNm de SERCA3 nos supone una regulación a nivel de la transcripción del gen ATP2A3. El promotor del gen ATP2A3 posee múltiples elementos cis para la unión de factores de transcripción de la familia Sp, la cual comprende Sp1-4 y KLF1-17. El estudio de la regulación transcripcional del gen ATP2A3 en endotelio de ratón y en linfocitos humanos, coinciden en que los factores Sp modulan su expresión. El factor KLF4 se expresa abundantemente en el epitelio intestinal, donde resulta esencial para su diferenciación terminal. En cáncer gástrico y de colon la expresión de KLF4 al igual que la de SERCA3, se encuentra disminuida y además, en los modelos de diferenciación con butirato así como el inducido por confluencia, se observa un aumento en la expresión de éste factor. A pesar del incremento concomitante en la expresión de KLF4 y SERCA3, no se ha identificado interacción directa de KLF4 con su secuencia blanco en el promotor del gen ATP2A3, modulando así su expresión. Por lo tanto, nos proponemos investigar si los factores KLF4, Sp1 y Sp3, interaccionan directamente con su secuencias consenso en el promotor del gen ATP2A3 regulando negativa o positivamente la expresión del gen en células del epitelio intestinal, tumorales e inducidas a diferenciación. Previamente en nuestro laboratorio hemos clonado la región reguladora-5´ del gen ATP2A2 humano y generado varias construcciones en pGL3-basic (Zarain-Herzberg and Alvarez-Fernandez, 2002). La región proximal del gen ATP2A2 tiene 4 sitios de unión para factores Sp, una TATA-box consenso y un elemento de respuesta a estrés del RE. Hemos estudiado el papel del [Ca2+]i en la transcripción del gen en cardiomiocitos en cultivo. Los resultados sugieren que variaciones en la [Ca2+]i se modulan por un mecanismo de retroalimentación la transcripción del gen ATP2A2, para lograr un control fino del transporte de Ca2+ en el cardiomiocito (manuscrito en preparación). Recientemente en nuestro laboratorio hemos clonado la región reguladora-5´ del gen ATP2A3 humano y generado varias construcciones en pGL3-basic (resultados no publicados). La región del promotor del gen ATP2A3 tiene varios sitios putativos de unión para factores Sp, KLF y un sitio para el factor Ets-1, pero no contiene TATA-box (Dode et al., 1998; Hadri et al., 2002). Se ha demostrado para otros genes que en ausencia de una TATA-box, los sitios de unión para Sp pueden funcionar para reclutar los factores de transcripción basales y la ARN polimerasa II. Resultados preliminares de nuestro laboratorio demuestran que la expresión del ARNm endógeno para SERCA3 se induce significativamente en células Caco-2 inducidas a diferenciar por confluencia. De forma similar en la misma línea celular se ha reportado que se activa la transcripción del gen NHE3 mediada por elementos de unión Sp localizados en la región del promotor (Kiela et al., 2007). En este proyecto nos proponemos investigar la actividad transcripcional del gen ATP2A3 por medio de ensayos funcionales de construcciones quiméricas del promotor del gen ATP2A3 en el vector de pGL3-basic que contiene luciferasa como reportero. Los resultados del proyecto contribuirán al conocimiento de la participación de las bombas SERCA2 y SERCA3 en la patogénesis y tratamiento del cáncer.