Antecedentes. La enfermedad de Hodgkin (EH) es de las neoplasias pediátricas más frecuentes, presenta un nivel máximo de aparición en la adolescencia y tiene una tasa de supervivencia de 80-95% a 10 años. En México, se sabe que de todas las neoplasias malignas en edad pediátrica los linfomas ocupan el 19.5% y en el Instituto Nacional de Pediatría ocupa el cuarto lugar dentro de las neoplasias malignas. Los tratamientos quimioterapeúticos que han sido exitosamente utilizados son: MOPP (mostaza nitrogenada, vincristina, procarbazina y prednisona) y ABVD (adriamicina, bleomicina, vinblastina y dacarbazina) y radioterapia en la mayoría de los casos. Algunos de estos compuestos son agentes alquilantes o radiomiméticos que provocan rupturas en el DNA y son inductores de translocaciones cromosómicas. La procarbazina es importante porque se sabe que puede alcanzar las células madre germinales masculinas y esto podría generar daño genómico a largo plazo. Se ha reportado que el esquema MOPP es muy efectivo pero más tóxico que el de ABVD porque hasta en un 20% en los pacientes se presentan segundas neoplasias como tumores sólidos, linfomas no Hodgkin (LNH) y leucemia no linfoblástica (LNL), y en células germinales se ha reportado citotoxicidad que se presenta como azoospermia y oligospermia, que pueden ser transitorias o definitivas (Van Hummmelen, 1996).También se sabe que el esquema ABVD tiene buenos resultados en sobrevida y los sobrevivientes presentan menos efectos tóxicos secundarios que los tratados con MOPP en relación a la producción espermática. Sin embargo, recientemente la Dra. Frías y cols. encontraron una elevada frecuencia de alteraciones cromosómicas estructurales en linfocitos de pacientes tratados con MOPP y ABVD por medio de bandas G y M-FISH (Cariotipo espectral) en contraste a lo observado en células sin tratamiento y en individuos sanos; estas se presentaron entre 1 y 20 años después del tratamiento por lo que es muy probable que exista daño en las células madre hematopoyéticas. Debido a que el daño cromosómico encontrado fue primordialmente estructural, es de gran importancia conocer el efecto de la genotoxicidad de los tratamientos MOPP y ABVD en las células germinales, ya que afecta de manera importante la fertilidad y salud reproductiva de los pacientes, así como su salud general y es posible que esto afecte a su descendencia, cuando la reproducción es posible. En este proyecto se buscará el daño cromosómico estructural en los espermatozoides de los pacientes con EH tratados con MOPP y ABVD por medio de hibridación multicolor AM8. Método: El FISH multicolor AM8 es un ensayo que permite identificar aberraciones cromosómicas desbalanceadas en células interfásicas, como deleciones, duplicaciones y alteraciones numéricas para el cromosoma 1 y del 8 que tienen especial importancia en la génesis de leucemia aguda no linfoblástica.Se estudiarán 4 grupos de individuos masculinos (por la facilidad de obtención y número de células germinales): I. Grupo de 20 sujetos sanos II. Grupo de 10 pacientes con EH sin tratamiento III (condicionado). Grupo de 10 pacientes con EH tratados con MOPP. IV. Grupo de 10 pacientes con EH tratados con ABVD. Todos los participantes serán mayores de 18 años, firmarán una carta de consentimiento informado, contestaran cuestionario de tamizaje y donaran una muestra de semen por masturbación. Serán canalizados de: Instituto Nacional de Pediatría (Clínica de sobrevivientes a EH), Instituto Nacional de Cancerología (Depto. de Hematología) y Hospital General de México (Depto. de Oncología).

En estudios previos en linfocitos proveientes de sujetos con Enfermedad de Hodgkin, se ha encontrado que el tratamiento con MOPP induce daño cromosómico estructural hasta 20 años después del tratamiento (10). En cuanto al esquema ABVD, en un estudio (11) de tipo antes y después (1-2 años post-tratamiento), utilizando M-FISH para 24 cromosomas, se encontró que los pacientes presentan alteraciones cromosómicas tanto numéricas como estructurales, con predominio de éstas últimas, sobre todo a nivel de translocaciones; en todas las muestras analizadas se observaron lesiones cromosómicas reunidas (translocaciones, anillos, dicéntricos, etc), pero también se encontraron del tipo no reunidas o inestables como rupturas cromatídicas y cromosómicas, que aumentaron también después de un año de haber terminado el tratamiento. Los resultados de ambos estudios indican que tanto MOPP como ABVD tuvieron consecuencias genotóxicas en linfocitos con las siguientes conclusiones: 1) Los agentes anticáncer provocaron inestabilidad cromosómica del tipo daño estructural. 2) El tratamiento anticáncer afectó genes implicados en la reparación y vigilancia del DNA en células troncales hematopoyéticas. Lo anterior nos conduce a investigar si en células germinales se encuentra también daño estructural, cabe mencionar que los estudios que se han realizado en espermatozoides en sobrevivientes de EH han sido primordialmente para detección de daño numérico (9). Por lo tanto la búsqueda de daño estructural en espermatozoides es sumamente necesaria, debido a que su posible presencia tendría una repercusión muy importante en la salud reproductiva de los pacientes y de sus descendientes. Sin embargo, hasta la fecha no existen reportes en la literatura en los que se haya investigado la existencia de daño estructural. Una de las razones es la gran dificultad para estudiar alteraciones cromosómicas estructurales en células en interfase, como los espermatozoides, sin la necesidad de inducir la división celular. El método AM8 permite conocer de manera eficiente la frecuencia de alteraciones estructurales y numéricas en células en interfase como los espermatozoides; se utilizan los cromosomas 1 y 8, en el cromosoma 1 se marcan dos regiones, la subtelomérica del brazo corto (verde) y la región centromérica (amarillo) y en el cromosoma 8 sólo el centrómero (aqua) (11). La importancia del doble marcaje en el cromosoma 1 se enfoca en la longitud del segmento involucrado, ya que están separadas aproximadamente por el 4% del genoma (12), además de ser representativo para aberraciones cromosómicas estructurales mediante la estimación potencial de rupturas generales para todo el genoma, debido a que contienen regiones de secuencia única, de secuencia repetitiva, sitios frágiles, etc. El marcaje del cromosoma 8 permite conocer el daño numérico y se selecciona porque tiene especial importancia en la génesis de leucemia aguda no linfoblástica (13) que es una de las neoplasias secundarias más comunes en EH. El ensayo AM8 detecta rupturas cromosómicas y rearreglos que ocurran en las células madre durante la mitosis o meiosis de la espermatogénesis (11). En este proyecto se utilizará una variante del ensayo AM8 en la que se adicionará el marcaje del telómero del brazo largo del cromosoma 1 (rojo) con la finalidad de incrementar el porcentaje de material genético analizado en los espermatozoides. Los resultados de este estudio aportarán conocimiento importante y nuevo en el campo de la genética toxicológica y toxicología reproductiva en células germinales humanas. El estudio será útil para seleccionar futuros tratamientos antineoplásicos y para ofrecer asesoría y manejo a aquellos pacientes en los que se encuentre daño genético en sus células germinales, principalmente. Además a nivel técnico, se implementara en el laboratorio de Citogenética y Mutagénesis de la FES-Zaragoza, el método de FISH AM8 (con variante subtelomerica del brazo q del cromosoma 1 (rojo), ensayo novedoso y eficiente para evaluar daño estructural en espermatozoides humanos. Así mismo se capacitarán a dos personas en la elaboración y análisis de FISH-AM8 en células interfásicas.Es importante mencionar que se tiene ya experiencia en FISH, con sondas pantelomericas utilizadas para verificar la acción clastogénica de compuestos de cobre II (Casiopeínas)(18) hasta la fecha. Referencias Citadas: 9. Sánchez Silvia, Rivera Luna Roberto, Niembro Ana, Molina Bertha, Lozano Valentín, Gallardo Emma, Carnevale Alessandra, Frias Guadalupe, Frias Sara (2011) Genotoxic consequences of MOPP chemotherapy in sperm from Hodgkin’s disease patients. Pediatric Blood & Cancer, 56:(5, may) 876–894. 10.Salas Consuelo, Rivera Luna Roberto, Niembro Ana, Molina Bertha, Sánchez Silvia, Ramos Sandra, Pérez-Vera Patricia, Lozano Valentín, Gallardo Emma, Carnevale Alessandra, Frias Sara. Persistent chromosomal instability in peripheral blood lymphocytes of Hodgkin´s disease survivors who received MOPP combination therapies (En proceso) 11. Ramos Sandra, Navarrete Pilar, Castro Oscar, Molina Bertha, Lozano Valentín, Gallardo Emma, Frias Sara. (2011) Detection of chromosomal aberrations in lymphocytes from Hodgkin disease patients treated with ABVD one year before. Pediatric Blood & Cancer, 56:(5 mayo), 876–894. 12. Van Hummelen P, Lowe XR, Wyrobek AJ. (1996) Simultaneous detection of structural and numerical chromosome abnormalities in sperm of healthy men by multicolor fluorescence in situ hybridization. Human Genetic 98: 608-615. 13. Mendelsohn M, Mayall L, Bogart BH, Moore II DH, Perry BH, DNA content and DNA based centromere index of the 24 human chromosomes. Science 1973; 179:1126-1129. 18. A combination of micronucleus assay and a FISH technique for evaluatión of the genotoxicity of Casiopeinas®. Roldán Elia, Guevara Soledad, Martínez Ana Laura, Molina Bertha, Frías Sara. (En preparación)