El plasma germinal en pez cebra está compuesto por una nube mitocondrial, fibrillas, así como proteínas y RNAs ; estos componentes son depositados durante la ovogénesis. Durante la ovogénesis temprana los RNAs de vasa, dazl y nanos colocalizan con el cuerpo de Balbiani y son llevados junto con el al polo vegetal del ovocito, formando un gradiente desde el polo vegetal. Al final de la ovogenesis dazl se localiza únicamente en el polo vegetal, mientras que vasa se localiza en todo el ovocito y nanos se anclan a la corteza durante la maduración del ovocito hasta que se lleva a cabo la fertilización(Kosaka et al 2007). Esta localización diferencial es interesante ya que sugiere una regulación muy fina de los componentes del plasma germinal durante la ovogénesis. El ensamble, la migración y la segregación correcta de los RNAs del plasma germinal dependen de las estructuras del citoesqueleto y de proteínas que regulan su dinámica como son las Rho-GTPasas. Las Rho-GTPasas son una familia de proteínas pequeñas que participan como interruptores en la regulación de múltiples procesos celulares. Las proteínas efectoras son a su vez las que llevan a cabo sus efectos sobre el citoesqueleto (Etienne- Manneville & Hall, 2002). Una de las Rho-GTPasas que más han sido estudiadas es Rhoa y sus principales proteínas efectoras son dos: ROCK y las forminas. ROCK es una cinasa que, cuando se une a Rhoa, promueve la activación de la miosina(Stuart et al 2008). Las forminas fomentan la polimerización de cables de actina (Young & Copeland, 2010). En el pez cebra, mutantes con defectos maternos en el citoesqueleto, o embriones normales donde los defectos sean provocados por drogas inhibidoras del citoesqueleto evitan el ensamble del plasma germinal (Hashimoto et al, 2003; Urven et al, 2006 ). Rhoa ha sido implicada en la localización de mRNAs en pseudopodios de células tumorales a través de la vía Rhoa- ROCK - myosina II (Stuart et al, 2008). La motilidad e integridad de las mitocondrias en células en cultivo de Drosophila esta mediada a través de la vía de Rhoa mediada por las forminas (Minin et al 2006); estos datos resultan interesantes ya que se sabe que al inicio de la ovogénesis el plasma germinal se localiza en el cuerpo de Balbiani el cual se caracteriza por contener una nube densa de mitocondrias. El cuerpo de Balbiani es la primera asimetría que se muestra en los ovocitos de todos los vertebrados incluyendo los mamíferos. En pez cebra se sabe que es necesaria la formación del cuerpo de Balbiani para que se segreguen de manera correcta los RNAs (Dosch et al., 2004). Experimentos realizados en el laboratorio mostraron una clara localización de Rhoa en el cuerpo de Balbiani. En el presente proyecto se estudiará la participación de Rhoa, en la segregación del plasma germinal en pez cebra durante la ovogenesis. Determinaremos cual o cuales de las isoformas de las Rhoa se expresan durante la ovogénesis. También estudiaremos los patrones de expresión de ROCK y de las forminas presentes en pez cebra. Montaremos el cultivo de ovocitos lo que nos permitirá abatir la actividad de las Rhoa y de ROCK . También con esta metodología podemos evaluar la posible función de las forminas transfectando mutantes constitutivamente activas y RNA interferentes. Los resultados de este trabajo generaran publicaciones en revistas indexadas importantes en el área. Además de que se titulara de Doctorado el alumno Jerónimo Miranda.

La distribución y localización de las macromoléculas se encuentra altamente organizada, se han descrito numerosos ejemplos de RNA mensajeros con localización específica desde levadura hasta el humano; esto indica que la localización molecular es un proceso conservado evolutivamente y marca la importancia del proceso de segregación de componentes celulares. Se ha propuesto que los componentes que intervienen en un proceso biológico en común (vía de señalización, ruta metabólica etc) se asocian físicamente formando complejos macro-moleculares altamente estructurados con una localización subcelular espacio-temporal específica; de lo contrario esto puede promover el desarrollo de diferentes tipos de patologías. El proceso de segregación de los componentes celulares es tan importante que participa durante el desarrollo embrionario en diferentes procesos como son: la definición de los ejes dorso-ventral y antero-posterior; migración y adhesión celular, la división asimétrica y en la plasticidad sináptica entre otros. Se sabe también que participa en la determinación de linajes celulares como es el caso de la línea germinal durante la segregación de lo que se conoce como plasma germinal. El plasma germinal,el cual es un grupo particular de proteínas y RNAs mensajeros, se segrega de manera muy específica desde la ovogénesis y sigue patrones muy característicos durante el desarrollo embrionario temprano. El estudio de segregación de RNAs del plasma germinal durante la ovogénesis permitirá entender este proceso a mayor profundidad. El citoesqueleto y proteínas que regulan su dinámica como son las Rho-GTPasas parecen jugar fundamental en este proceso. Las Rho-GTPasas son una familia de proteínas pequeñas que participan en la regulación de múltiples procesos celulares, como es la regulación génica, la apoptósis y la remodelación del citoesqueleto, entre otros; y se encuentran conservadas evolutivamente desde levadura hasta los humanos. En el humano hay 16 miembros de esta familia, sin embargo los mas estudiados han sido Rac1, CDC42 y RhoA. Existe evidencia que apoya la hipótesis de que las Rho-GTPasas participan en el transporte de RNAs tal es el caso de Cdc42 y Rac1 que forman parte de complejos con proteínas del citoesqueleto y con la proteína Staufen; la cual se sabe participa en el transporte de RNAs en el desarrollo temprano de Drosophila y en neuronas de organismos adultos. Por otra parte RhoA ha sido implicada en la localización de RNAs mensajeros en seudópodos en células tumorales y en fibroblastosen cultivo; mediando la vía de ROC/ROCK/miosinaII. En el presente proyecto se estudiará la participación de las Rho-GTPasas, en particular de Rhoa, en la segregación temprana del plasma germinal durante la ovogénesis. En el laboratorio contamos con una colonia de peces cebra, tenemos el equipo necesario para realizar inyecciones, cultivo de los embriones y de los ovocitos, tenemos montando los protocolos para in situ tanto en cortes de ovarios como en el órgano completo, al igual que para la detección de proteínas tanto por western blot. Contamos con las sondas que reconocen diferentes componentes del plasma germinal de pez cebra como son vasa, nanos dazl y dead-end, tambien contamos con las sondas que reconocen a las 5 rhoa. Además de contar con anticuerpos que reconocen de manera específica a la proteína RhoA, y a ROCK en pez cebra. Tambien tenemos el inhibidor tanto de RHoa como de ROCK. Todo lo anterior nos permitirá realizar el trabajo necesario para profundizar en la comprensión de los mecanismos celulares y moleculares que participan in vivo en el proceso desegregación de RNAs a regiones específicas dentro de la célula.