Recientemente en mi laboratorio descubrimos una nueva proteína inhibidora de 11 kDa asociada a la ATP sintasa de P. denitrificans y otras α-proteobacterias como Rhodobacter sphaeroides (Morales-Ríos y cols., 2010; García-Trejo y Morales-Ríos, 2008). Denominamos a esta proteína subunidad ζ por ser la sexta subunidad de la F1-ATPasa, adicional a las 5 subunidades canónicas presentes en todas las F1-ATPasas descritas (α, β, γ, δ, y ε). Además, dado que encontramos el gen de esta proteína en todas las α-protebacterias y que estas son predecesores evolutivos de las actuales mitocondrias, esta nueva subunidad ζ tiene implicaciones evolutivas y microbiológicas importantes. Hasta el momento sólo se conocían como subunidades reguladoras de la ATP sintasa a la subunidad ε en bacterias y a la IF1 en la enzima mitocondrial, de tal modo que el descubrimiento de una nueva proteína inhibidora en las α-proteobacterias, abre una línea de investigación totalmente nueva en el campo de la regulación de este nanomotor esencial para todas las formas de vida. Esto abre una nueva línea de investigación y un novedoso mecanismo de regulación que podría interferir con la rotación del cuello central de la F1, o con los cambios conformacionales de los sitios catalíticos de manera diferente a la subunidad a bacteriana o IF1 mitocondrial.._x000D_ Dado que se trata del nanomotor más pequeño, ubicuo y eficiente de la naturaleza, la resolución de este nuevo mecanismo de regulación adquiere una gran relevancia y requiere de estudios de estructura de proteínas a nivel atómico por cristalografía de rayos-X y/o Resonancia Magnética Nuclear (RMN). Esto combinado con los resultados obtenidos en el proyecto PAPIIT anterior (IN213809) donde se obtuvieron datos de mecanismo cinético de inhibición de la subunidad ζ, entrecruzamientos químicos, y contenido de estructura secundaria por dicoísmo circular, todo esto contribuirá a la resolución de la estructura de la F1-ATPasa de P. denitrificans por cristalografía de proteínas y difracción de rayos-X. La resolución de esta estructura y del novedoso mecanismo de regulación de esta proteína tendrá un alto impacto en el campo de los nanomotores moleculares, en particular en el de la ATP sintasa, en la evolución bacteriana y mitocondrial, así como en la microbiología bacteriana y en posibles aplicaciones biotecnológicas o nanotecnológicas de frontera._x000D_ Por lo tanto, el presente proyecto resolverá la estructura de la PdF1-ATPasa de P. denitrificans conteniendo a su novedosa subunidad inhibitoria, ζ. Esto requiere de la cristalización de la PdF1 y su resolución estructural atómica por difracción de rayos-X para resolver este novedoso mecanismo de inhibición en el campo de lo nanomotores moleculares. Es por todo esto que este proyecto llamó la atención del Premio Nobel, Dr. Sir John E. Walker, de Cambridge, UK, quien solicitó colaborar con mi laboratorio en este proyecto y por lo tanto en su laboratorio se llevarán a cabo los estudios finales de cristalización y resolución de la estructura atómica de la F1-ATPasa de P. denitrificans. Adicionalmente, un segundo premio Nobel, el Dr. Kurt Wühtrich, del Scrips Research Institute, de USA, colaborará en la resolución de la estructura terciaria de la subunidad ζ aislada por Resonancia Magnética Nuclear para que por reemplazo molecular en el cristal de la PdF1-ATPasa se resuelva la estructura y mecanismo completo de control de la PdF1-ATPasa._x000D_

Contribución del Proyecto_x000D_ _x000D_ Las metas científicas del proyecto son de muy alto impacto a nivel internacional dado que contribuirán al conocimiento del nuevo mecanismo molecular de regulación del nanomotor F1-ATPasa de P. denitrificans y de la familia de las α-proteobacterias donde nuestro grupo descubrió que se encuentra esta proteína inhibidora (ζ). Hasta el momento sólo se conocían como subunidades reguladoras de la ATP sintasa a la subunidad ε en bacterias y a la IF1 en la enzima mitocondrial, de tal modo que el descubrimiento de una nueva proteína inhibidora en las α-proteobacterias, abre una línea de investigación totalmente nueva en el campo de la regulación de este nanomotor esencial para todas las formas de vida. Este alto impacto en el campo de la Bioenergética a nivel molecular ha promovido colaboraciones de altísimo prestigio a nivel internacional con los dos Premios Nobel de Química que se mencionan en el proyecto (Dr. Walker en Cambridge, UK; y Dr. Wüthrich en California, USA). Esto además tiene un impacto en el campo de la transición evolutiva de las α-proteobacterias hacia las mitocondrias de acuerdo a la teoría endosibiótica de Lynn Margulis, dado que el género Paracoccus es muy cercano evolutivamente al proto-endosimbionte que dió origen a las actuales mitocondrias. Esto debido a que este proyecto contribuye a comprender cómo han ido evolucionando los mecanismos de regulación del nanomotor en esta transición evolutiva del proto-endosimbionte hacia la enzima mitocondrial. En particular, el proyecto dará información para entender si la estructura y mecanismo de la subunidad ζ es un precedecesor evolutivo de la proteína inhibidora de la enzima mitocondrial (IF1) o si se trata de una proteína totalmente diferente cuyo gen se perdió en esta transición endosimbiótica. Además de todo esto, este proyecto abre posibles aplicaciones en el campo de la microbiología del género Paracoccus, de la biofísica de nanomotores moleculares a nivel internacional, y muy probablemente en la biotecnología aplicada del género Paracoccus. En cuanto a recursos humanos se refiere, se formarán al menos dos tesis doctorales y una de maestría, de los alumnos listados en los participantes._x000D_ _x000D_ Esta colaboración con el Dr. Walker es una garantía de éxito al 100% dado que el premio Nobel se lo otorgaron por resolver la mayoría de las estructuras atómicas de las F1-ATPasas bacterianas y mitocondriales, por lo tanto resolveremos este novedoso mecanismo de regulación de la F1-ATPasa de las α-proteobacterias a la mejor resolución atómica posible._x000D_ Inicialmente, se publicarán las purificaciones y estudios de entrecruzamiento químico para conocer las subunidades cercanas o en contacto con la nueva subunidad ζ, inhibidor de la F1-ATPasa de P. denitrificans (PdF1). Actualmente ya hemos logrado reconstituciones exitosas pero con cantidades limitadas de proteína (Morales-Ríos y cols., 2010). Sin embargo, falta escalar en grandes volúmenes y cantidades de proteína necesarios para los ensayos de cristalización. Además de esto, se cristalizará a la PdF1 conteniendo a la subunidad ζ y ε en cantidades estequiométricas. Esto con el objetivo de definir el mecanismo de unión y de inhibición de esta nueva subunidad inhibitoria en la PdF1. Cuando se obtengan los primeros cristales y resolución de la densidad electrónica de la proteína a baja resolución, se hará una segunda publicación, con los resultados preliminares del cristal obtenido. Posteriormente, se realizará un modelo estructural de la cadena polipeptídica de la PdF1 para que se acomode dentro de la densidad electrónica resuelta por difracción de rayos-X, esto por reemplazo molecular a partir de las estructuras previamente resueltas de las F1-ATPasas bacterianas (E. coli y Bacillus PS3), así como de las coordenadas obtenidas de las subunidades ζ por RMN y ε por modelado molecular. Una vez generado el modelo inicial, se procederá a refinar la estructura hasta una resolución aproximada de 2.5-3.0 Å esto gracias a un nuevo sistema de crio-cristalización además de difracción en sincrotrón (European Synchrotron Radiation Facility, Grenoble, Francia). Se tratará de resolver primero la PdF1 con sus subunidades endógenas, y se publicarán los resultados con la estructura y el nuevo mecanismo de inhibición a la brevedad posible en una revista de muy alto nivel, dado lo novedoso del mecanismo de inhibición. Existen tres posibilidades para este mecanismo, 1) que ζ inhiba el giro del rotor central de la PdF1, 2) que impida los cambios conformacionales de los sitios catalíticos, 3) que haga ambas cosas anteriores. En cualquiera de los casos, la publicación será de alto nivel e impacto, y si además esta proteína impide la rotación, esto traerá en consecuencia la colaboración con otros grupos trabajando con nanomotores a nivel unimolecular para discernir el mecanismo fino de inhibición de la rotación._x000D_ _x000D_ En resumen, además de resolver este nuevo e importante mecanismo de regulación del nanomotor más importante de la naturaleza, generaremos al menos 3 artículos de muy alto impacto en las mejores revistas, además de concluir 2-3 tesis doctorales y/o de maestría, generar una posible plaza post-doctoral, y numerosos trabajos en congresos nacionales e internacionales. Además de la colaboración UNAM-Cambridge (UK)- Scripps Research Institute (USA) ya establecida, se abrirá la pauta de posibles colaboraciones y aplicaciones en el campo de los nanomotores, análisis uni-molecular y biotecnológicos de frontera con otros laboratorios a nivel internacional._x000D_