Las pirofosfatasas inorgánicas solubles (siPPiasas) son enzimas esenciales para la vida presentes en todas las células. En los Eucariontes, suele presentarse más de una isoforma y en el caso de las plantas se detectan 4 o más isoformas cuya localización intracelular ha sido determinada sólo en un par de casos (Rojas-Beltran et al., 1995; Sculze et al., 2004) y no de manera directa. En la planta modelo Arabidopsis thaliana, se sabe que los mensajeros se expresan de manera casi constitutiva, a pesar que los perfiles de actividad varían considerablemente entre los tejidos (Navarro de la Sancha et al, 2007). Por otro lado, la concentración de pirofosfato (PPi) en el citoplasma de las células vegetales resulta muy constante, aún bajo condiciones de estrés por deficiencia de fósforo (Richer and Randal, 1994; Carswell et al., 1997). Los datos anteriores y varios estudios con plantas transgénicas (Farré et al., 2001) apuntan a una liga muy relevante entre el metabolismo del PPi y el desarrollo de la planta . Tal vínculo carece aún de una explicación satisfactoria, en parte, por la ausencia de estudios detallados sobre algunas de las enzimas relevantes, comenzando por las más obvias, las pirofosfatasas inorgánicas solubles (siPPiasa). Son contadas las publicaciones sobre estudios realizados con preparaciones homogéneas y en las que la isoforma en estudio se haya identificado sin ambigüedad. Así, el estudio de las características cinéticas y moleculares individuales de las varias isoformas presentes en plantas son muy recientes (Gómez-García et al., 2006; Navarro de la Sáncha et al., 2007). Resulta peculiar que se cuente con una mejor caracterización de las pirofosfatasas de protones de plantas (Maeshima, 2007), que las formas solubles. Por ello, en el laboratorio nos hemos dado a la tarea de estudiar con más detalle a las siPPiasas de fuentes vegetales tratando de determinar sus características cinéticas y moleculares, empleando para ello una combinación de técnicas experimentales y computacionales que se complementan. Paralelamente, se buscará determinar su ubicación intracelular y sus niveles de expresión bajo condiciones de estrés por deficiencia de fósforo, lo que resulta de interés para la agricultura mexicana. Concretamente proponemos estudiar los niveles de expresión de las diferentes isoformas de las pirofosfatasas inorgánicas solubles en frijol y en Arabidopsis thaliana, a nivel de mensajes, de proteína y de actividad. Dichos estudios se realizarán tanto en plantas control, como en plantas sometidas a deficiencia de fósforo. Paralelamente, complementaremos los estudios con proteínas homogéneas para poder comparar las características cinéticas y moleculares de las diferentes isoformas. Se buscará además evidencia de mecanismos que permitan a la planta regular su actividad. Tal información se relacionará con sus perfiles de expresión, en búsqueda de papeles fisiológicos para estas proteínas. Además complementaremos estos estudios con modelos computacionales de la estructura tridimensional bien validados y estudiaremos la relación entre las características cinéticas observadas y la estructura de estas proteínas para fundamentar los datos a nivel molecular. Cuando sea posible se complementarán estos estudios con la determinación de la estructura cristalográfica. Finalmente, se obtendrán mutantes nulas de estas isoformas y se estudiará su fenotipo bajo diferentes condiciones de estrés. El análisis de toda esta información podrá proporcionar elementos para proponer mejores modelos para el papel del pirofosfato en las plantas, lo que esperamos, aporte nuevas ideas para resolver de manera integral, el problema de los suelos pobres en la agricultura en México.

La caracterización molecular y cinética de las pirofosfatasas inorgánicas solubles que se plantea en este proyecto contribuirá directamente a la comprensión de los mecanismos bioenergéticos en el metabolismo vegetal. No obstante que el pirofosfato ha sido considerado por mucho tiempo como un desecho de las reacciones biosintéticas, muchos datos recientes sugieren que tiene un papel importante en la regulación del crecimiento de las plantas, participando directamente en el control del metabolismo de carbohidratos complejos y de su movilización entre los tejidos de la planta. Una de las limitantes para entender la compleja red de interelaciones metabólicas que rodean al pirofosfato es la ausencia de información cinética, estructural y molecular sobre las pirofosfatasas inorgánicas solubles en los organismos vegetales. Así, el presente proyecto pretende ampliar notablemente el conocimiento de estas proteínas, lo que, estamos seguros, nos permitirá plantear mejores modelos de su participación en el metabolismo general de la planta y su importancia en la fisiología de la planta. El mejor entendimiento de la actividad de las pirofosfatasa solubles y su regulación nos pondrá en posibilidad de comprenden mejor la respuesta de las plantas a condiciones de estrés. La actividad de las pirofosfatasas implica la hidrólisis del pirofosfato y, por ende, una disponibilidad de fósforo en las pozas citoplasmáticas. Varios estudios coinciden en implicar a las pirofosfatasas como responsables de mantener constantes los niveles de pirofosfato además de considerarse esenciales en todos los organismos. De especial importancia para la agricultura en nuestro país resulta la deficiencia de fósforo. siendo el frijol uno de los cultivos más afectados. El presente proyecto contribuirá significativamente a la comprensión del flujo del fosfato y la participación de las pirofosfatasas en la respuesta a estrés por deficiencia de fósforo. Ciertamente, no todo el proyecto se centra en las proteínas del frijol, sino que se considera también a la planta Arabidopsis thaliana, que no posee importancia agrícola. Sin embargo, Arabidopsis es un modelo muy bien caracterizado que proporcionará herramientas moleculares para el estudio de la fisiología y la bioquímica en otros sistemas, incluido frijol. Pensamos que el uso de ambos modelos nos permitirá obtener avances importantes en poco tiempo. Esperamos que dichos resultados den una base para la mejora de las variedades de frijol y de otras especies de interés agrícola, en un futuro no muy lejano. Finalmente, pero no menos importante, este proyecto contribuirá a la formación de recursos humanos en la bioquímica y biología molecular de plantas, área de investigación muy relevante para el desarrollo de la agricultura mejicana y que, desafortunadamente, no ha recibido la misma atención que estudio de sistemas animales en nuestro país.