En el año 2006 se reportó que los esfingolípidos son esenciales para las plantas al probarse que la no expresión de la subunidad catalítica de la enzima que realiza la primera reacción de síntesis de esfingolípidos resultaba letal para la planta de Arabidopsis. Ese mismo año se reveló la enorme diversidad de estos lípidos en las plantas, por lo que el estudio de su significancia funcional se intensificó. Nuestro grupo ha contribuido a describir varios componentes en la vía de transducción de señales que conduce a una forma de muerte celular programada que está mediada por los esfingolípidos más simples y que son los precursores de los esfingolídos complejos: las bases de cadena larga. Adicionalmente, hemos desarrollado metodologías que nos permiten estudiar la relevancia de los esfingolípidos complejos en la estructura membranal. En el presente proyecto proponemos ampliar y profundizar los aspectos que hemos venido estudiando en los últimos años._x000D_ Con respecto a la importancia de los esfingolípidos complejos en la estructura membranal, pretendemos: A) determinar la distribución de especies de esfingolípidos complejos en las dos principales membranas de la célula vegetal: la membrana plasmática y el tonoplasto (membrana de la vacuola). B) establecer la contribución de los esfingolípidos complejos a la fluidez y permeabilidad membranal. C) estudiar la interacción esfingolípido-ATPasa para ilustrar el papel modulador de este tipo de lípidos membranales en la función de proteínas integrales de membrana y para conocer el impacto que puede tener el ambiente de los microdominios membranales en la catálisis de proteínas que ahí son reclutadas._x000D_ Con respecto a la acción de los esfingolípidos más sencillos, las bases de cadena larga, sobre los mecanismos de defensa contra patógenos, pretendemos A) describir una forma molecular adicional a través de la cual los esfingolípidos contribuyen a combatir la infección por patógenos bacterianos, o sea a través de la modulación de la actividad de la ATPasa de H+ para evitar el ingreso de patógenos por los estomas. B) valorar la participación de los esfingolípidos en los dos principales tipos de inmunidad. C) establecer la posible función dual de las especies reactivas de oxígeno generadas por la acumulación de BCL en la progresión de la muerte celular programada dilucidando la participación del cloroplasto como sitio generador de especies reactivas de oxígeno y como fuente energética celular cuyo apagamiento fija el punto de no retorno de la muerte celular inducida por la elevación de las BCL. _x000D_ Queremos estudiar lo anterior en plantas de Arabidopsis, ya que tenemos una serie de mutantes que expresan disfunciones en el contenido de esfingolípidos y que nos permiten establecer comparaciones con el genotipo silvestre. Afortundamente, tenemos ya mucha experiencia con los sistemas experimentales que manejamos y tenemos entrenamiento y conocimientos en todas las técnicas que estamos proponiendo, excepto en la determinación de aperturas y conductancias estomáticas. Actualmente hay 2 estudiantes de maestría trabajando en este tema y 4 más de licenciatura. Contamos con el apoyo de la Dra. Rosario Vera para obtener tonoplastos, del Dr. Felipe Cruz para la parte de la Biología Molecular y del Dr. Edgar B. Cahoon para realizar los estudios de análisis de lípidos. _x000D_ Creemos que este trabajo puede aportar evidencias sobre aspectos muy relevantes de la participación de los esfingolípidos en las plantas._x000D_

CONTRIBUCIÓN DEL PROYECTO_x000D_ _x000D_ Continuaremos tratando de aportar evidencias experimentales que expliquen la gran diversidad de especies moleculares de esfingolípidos en las plantas y la naturaleza esencial de estos lípidos para el reino vegetal. La justificación de estas características debe estar relacionada con la función especializada que las diferentes especies moleculares han ido adquiriendo evolutivamente en las plantas. Para ello, seguiremos estudiando dos vertientes conocidas de la funcionalidad de los esfingolípidos: su implicación en la estructuración de las membranas más extensas de la célula vegetal y en las vías de defensa contra patógenos._x000D_ _x000D_ 1. DETERMINACIÓN DE LA DISTRIBUCIÓN DE ESPECIES DE ESFINGOLÍPIDOS COMPLEJOS EN LAS DOS PRINCIPALES MEMBRANAS DE LA CÉLULA VEGETAL: LA MEMBRANA PLASMÁTICA Y EL TONOPLASTO (MEMBRANA DE LA VACUOLA)._x000D_ Hasta ahora hemos desarrollado técnicas y condiciones para crecer plantas de Arabidopsis en gran escala y poder aislar fracciones membranales y sub-membranales en cantidad suficiente para hacer estudios completos de análisis comparativo de glicerolípidos y esfingolípidos por HPLC-MS/MS. Nuestro grupo aislará las membranas y el del Dr. Cahoon hará la lipidómica. Ya hemos llevado a cabo ensayos preliminares para calcular cantidades y rendimientos. Los resultados serían muy importantes para dar idea de la biogénesis y clasificación lipídica (sorting) en la membrana plasmática y el tonoplasto, así como de las propiedades de esta membranas derivadas de su composición lipídica para sostener las funciones de elongación y tonicidad. _x000D_ _x000D_ 2. CONTRIBUCIÓN DE LOS ESFINGOLÍPIDOS COMPLEJOS A LA FLUIDEZ Y PERMEABILIDAD MEMBRANAL._x000D_ La modulación de la fluidez membranal puede ser la razón de la gran abundancia de los esfingolídos en plantas, ya que ésta es importante para soportar cambios de temperatura extremos y condiciones de estrés hídrico. Nuestras determinaciones de fluidez membranal en membranas obtenidas de plantas que han sido construidas genéticamente para tener contenidos lipídicos cuantitativa y cualitativamente diferentes pueden dar mucha luz en la asociación esfingolípido-fluidez-permeabilidad membranal. Anteriormente hemos medido ambas propiedades por fluorescencia y por escape de solutos._x000D_ _x000D_ 3. UTILIZAR EL CASO DE INTERACCIÓN ATPASA DE H+-ESFINGOLÍPIDOS COMPLEJOS PARA ILUSTRAR:_x000D_ A. EL PAPEL MODULADOR DE ESTE TIPO DE LÍPIDOS MEMBRANALES EN LA FUNCIÓN DE PROTEÍNAS INTEGRALES DE MEMBRANA EN GENERAL._x000D_ B. EL IMPACTO QUE PUEDE TENER EL AMBIENTE DE LOS MICRODOMINIOS MEMBRANALES EN LA CATÁLISIS DE PROTEÍNAS QUE AHÍ SON RECLUTADAS._x000D_ En el laboratorio se ha estudiado la influencia de los esfingolípidos en la actividad de la ATPasa de H+ de la membrana plasmática de plantas. Para ello, la enzima se ha estudiado en preparaciones membranales de plantas y plántulas de A. thaliana tanto del genotipo silvestre como de la línea mutante AtBCL2b hp/AtBCL2a. Esta última es una línea en la que los dos genes de la subunidad catalítica de la serina palmitoiltransferasa (SPT) han sido manipulados para no expresarse, uno de ellos (el que codifica para la subunidad BCL2a de la SPT), no se expresa de forma permanente y el otro deja de expresarse bajo la presencia de un inductor (el que codifica para la subunidad LCB2b de la SPT), por lo que estas plantas contienen 38% menos esfingolípidos que las plantas silvestres. _x000D_ Estas plantas tienen una actividad de ATPasa aumentada de cerca del 125 % y el aumento de actividad se puede explicar por un aumento en la Vmax de la enzima. Experimentos preliminares de reconstitución de vesículas membranales con fracciones lipídicas enriquecidas en esfingolípidos y con glicosil ceramida llevaron a una reducción de la actividad de la enzima, indicando que los esfingolípidos juegan un papel muy importante en el nivel de actividad de la ATPasa de H+._x000D_ Independientemente del valor intrínseco que tienen averiguar el mecanismo mediante el cual la ATPasa de H+ puede activarse por una disminución en los esfingolípidos membranales, este resultado es muy relevante en el estudio de la interacción esfingolípido-proteína, de la que no hay mucha información en la literatura. Igualmente, este caso puede ilustrar de forma muy aproximada, el efecto de un ambiente enriquecido en esfingolípidos, a semejanza de lo que ocurre en las balsas lipídicas. Lo anterior es un fenómeno que no ha podido ser abordado en la literatura debido a impedimentos técnicos relacionados con los tiempos de residencia de proteínas en las balsas lipídicas._x000D_ _x000D_ 4. DESCRIPCIÓN DE UN NIVEL MOLECULAR ADICIONAL A TRAVÉS DEL CUAL LOS ESFINGOLÍPIDOS CONTRIBUYEN A COMBATIR LA INFECCIÓN POR PATÓGENOS BACTERIANOS:_x000D_ Hasta ahora, en la literatura se ha reportado que las BCL orquestan vías que son importantes para implementar la defensa contra patógenos: a través de la acción de las BCL para mediar el cierre de los estomas y evitar así la entrada del patógeno (Ng et al. 2001) o a través de la vía de MCP-HR (Saucedo-García et al. 2011a). En este proyecto exploraremos un tercer frente de defensa medido por esfingolípidos: a través de la acción de los esfingolípidos complejos membranales sobre la ATPasa de H+, manteniéndola con bajos niveles de catálisis y por ello evitando el establecimiento de flujos iónicos desencadenados por canales sensibles a voltaje (gradiente eléctrico generado por la ATPasa) y manteniendo así cerrado el poro estomático al acceso del patógeno a la planta. Es importante mencionar que recientemente se ha demostrado que la actividad de la ATPasa de H+ puede definir le cierre o apertura de estomas (Elmore and Coaker, 2011). Nuestra contribución sería que los esfingolípidos a su vez podrían dirigir la actividad de esta enzima para mantener cerrado el estoma._x000D_ _x000D_ 5. VALORACIÓN DE LA PARTICIPACIÓN DE LOS ESFINGOLÍPIDOS EN LOS DOS PRINCIPALES TIPOS DE INMUNIDAD._x000D_ Nuestro grupo ha desarrollado mucho trabajo con diferentes mutantes en condiciones de acumulación de BCL (tratamiento con FB1) para exacerbar los cuadros de inmunidad. Este trabajo incluye el crecimiento en planta de cepas virulenta y avirulenta de Pseudomonas syringae y la determinación de H202 in situ, pero falta completar el perfil de genes de defensa y la determinación de especies reactivas de oxígeno de manera cuantitativa, si bien en esta parte ya hemos avanzado en el montaje de la técnica. Completado lo anterior, podríamos establecer la incidencia de las BCL en la inmunidad inducida por PAMPs o por la interacción gen por gen. Lo anterior es importante, pues puede contribuir a fortalecer el concepto que está actualmente en desarrollo de que ambos tipos de inmunidad son secuenciales. Y quedaría bien establecido que las BCL son parte de los mecanismos de inmunidad innata, lo cual les da una gran relevancia funcional. El único caso de defensa no-hospedero que ilustra este tipo de inmunidad no logró detectar cambios en BCL endógenas (Takahashi et al. 2009)._x000D_ _x000D_ 6. ESTABLECIMIENTO DE LA POSIBLE FUNCIÓN DUAL DE LAS ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO GENERADAS POR LA ACUMULACIÓN DE BCL EN LA PROGRESIÓN DE LA MUERTE CELULAR PROGRAMADA.Y DILUCIDACIÓN DE LA PARTICIPACIÓN DEL CLOROPLASTO COMO SITIO GENERADOR DE ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO Y COMO FUENTE ENERGÉTICA CELULAR CUYO APAGAMIENTO FIJA EL PUNTO DE NO RETORNO DE LA MUERTE CELULAR INDUCIDA POR LA ELEVACIÓN DE LAS BCL._x000D_ Este punto es muy importante en el esclarecimiento de los eventos moleculares que conducen a la MCP en plantas, ya que están poco entendidos. Tenemos experiencia en la inducción de la MCP por elevación de BCL endógenas, por lo que podemos incidir en la dilucidación de la contribución de la actividad fotosintética a la formación de ROS y a la irreversibilidad del camino hacia la muerte programada en este punto de revisión (check-point)._x000D_