ANTECEDENTES. Las especies reactivas de oxígeno (ERO) y de nitrógeno (ERN) causan daño oxidante a lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Las ERO se forman principalmente cuando el oxígeno molecular se reduce incompletamente por electrones que provienen de la mitocondria u otras fuentes para dar lugar a diversas especies como anión superóxido y radical hidroxilo. Por su parte la formación de ERN se inicia con la síntesis del óxido nítrico que al reaccionar con el anión superóxido se forma peroxinitrito, una molécula muy reactiva. Las células cuentan con sistemas antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos que normalmente neutralizan dichas especies reactivas. Sin embargo, cuando las ERO y ERN se producen copiosamente y rebasan la capacidad antioxidante de la célula y se genera daño oxidante el cual está asociado a diversas patologías. El consumo de alimentos de origen vegetal puede reducir la incidencia de enfermedades crónico degenerativas. La presencia de compuestos fitoquímicos con actividad antioxidante en frutas y verduras está asociada a sus efectos protectores. En este proyecto se plantea estudiar si la atenuación de las alteraciones mitocondriales y la preservación o inducción de enzimas antioxidantes contribuyen al efecto protector de los compuestos fitoquímicos curcumina, sulforafano, S-alilcisteína, ficocianina y astaxantina en diversos paradigmas experimentales asociados a estrés oxidante. OBJETIVO GENERAL. Estudiar los compuestos fitoquímicos curcumina, sulforafano, S-alilcisteína, ficocianina y astaxantina como agentes protectores frente al daño oxidante en varios modelos experimentales y establecer si la atenuación de las alteraciones mitocondriales y la preservación y/o inducción de enzimas antioxidantes via el factor de trasncripción Nrf2 están asociadas con su efecto protector. OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 1. Continuar los estudios sobre el mecanismo del efecto protector de la curcumina en cultivos primarios de neuronas granulares de cerebelo. 2. Continuar con los estudios del efecto de la curcumina sobre la progresión del daño renal en el modelo de insuficiencia renal crónica inducida por nefrectomía 5/6 en ratas. Con la realización de los objetivos 1 y 2 se dará continuidad a los estudios realizados con el financiamiento otorgado por PAPIIT en los tres años anteriores. 3. Continuar los estudios sobre el mecanismo del efecto hepatoprotector de la curcumina en ratas tratadas con dicromato de potasio. 4. Estudiar el mecanismo del efecto protector del sulforafano en la neurotoxicidad inducida por ácido quinolínico y en la nefrotoxicidad inducida por gentamicina en ratas. 5. Estudiar el mecanismo del efecto protector de S-alilcisteína, de ficocianina y de astaxantina en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino en ratas y en cultivos de células epiteliales de túbulo proximal renal de cerdo (LLC-PK1). 6. Estudiar el potencial efecto protector de S-alilcisteína en las neuronas granulares de cerebelo sometidas a estrés oxidante. MÉTODOS. En este proyecto se tienen contemplados diversos modelos in vivo e in vitro. La evaluación de la protección in vivo se realizará por el uso de diversas técnicas que evalúan daño funcional y estructural. La función mitocondrial se evaluará principalmente por oximetría y por la actividad de los complejos mitocondriales. El estrés oxidante se valorará por medio de técnicas como peroxidación de lípidos y proteínas oxidadas. También se evaluará la actividad y expresión de diversas enzimas antioxidantes como catalasa y glutatión reductasa así como la posible participación del factor Nrf2.

La realización de este proyecto nos permitirá contribuir al estudio del mecanismo del efecto protector de algunos compuestos fitoquímicos con capacidad antioxidante en diversos modelos experimentales de enfermedades y de daño asociado a estrés oxidante tanto in vivo como in vitro. Los compuestos fitoquímicos que contemplamos estudiar en este proyecto son curcumina, sulforafano, S-alilcisteína, ficocianina y astaxantina. La curcumina es el principal componente de Curcuma longa, se localiza principalmente en los rizomas y es el causante del color amarillo de esta planta. Este compuesto es utilizado como una especia en la dieta que proporciona el color amarillo y sabor característico al curry. El sulforafano es un isotiocianato que resulta de la hidrólisis enzimática del glucosinolato llamado glucorafanina, la cual está presente en los vegetales de la familia Cruciferae especialmente los pertenecientes al género Brassica como el brócoli. La S-alilcisteina es un derivado del aminoácido cisteína y es un compuesto antioxidante directo e indirecto que se encuentra en el ajo. Hemos encontrado que tiene propiedades renoprotectoras y neuroprotectoras. La ficocianina es una biliproteína que se encuentra presente en el alga espirulina; es soluble en agua, no es tóxica, tiene actividad antioxidante directa y se encuentra en algas verde-azules donde actúa como pigmento fotosintético recolector de luz. La astaxantina es una xantófila roja de tipo carotenoide que es abundante en la naturaleza, especialmente en los ambientes marinos, las algas sintetizan la astaxantina concentrándola dentro de la cadena alimenticia a través del zooplancton y crustáceos, los cuales son consumidos por el salmón, trucha y otros animales acuáticos. En diversos estudios se ha demostrado su capacidad antioxidante directa. Con este proyecto se piensa describir estrategias con antioxidantes dietarios para atenuar el daño en modelos de nefrotoxicidad, hepatotoxicidad y neurotoxicidad y así contribuir al desarrollo de nuevos tratamientos en pacientes con estas complicaciones. Además de estudiar el mecanismo por medio del cual estos compuestos fitoquímicos ejercen su efecto protector, la contribución de este proyecto consiste en tratar de establecer en diversos modelos experimentales la importancia de los antioxidantes en la dieta en la prevención o tratamiento de enfermedades. Los modelos contemplados en este proyecto son: insuficiencia renal crónica por nefrectomía 5/6, nefrotoxicidad por cisplatino y por gentamicina, hepatotoxicidad por dicromato de potasio y neurotoxicidad por ácido quinolínico. En el caso de la nefrectomía 5/6, estudiaremos si la curcumina es capaz de revertir el daño renal establecido pues su administración se iniciará cuando las ratas presentan insuficiencia renal. El hecho de que el daño se revirtiera tendría implicaciones terapéuticas muy importantes en pacientes con nefropatía y nos daría pauta para probar si esto sucede en otros modelos experimentales y con otros antioxidantes en este mismo proyecto. Desde luego que los resultados positivos de dichos hallazgos serían de mucho beneficio para pacientes con patologías asociadas a los modelos experimentales estudiados con la ventaja de que son antioxidantes que se pueden consumir en la dieta. También se realizarán estudios en cultivos primarios de neuronas granulares de cerebelo y en células epiteliales de túbulo proximal renal. El presente proyecto también contribuirá al estudio de los mecanismos por medio de los cuales los antioxidantes usados, ejercen sus efectos benéficos. Particularmente estamos interesados en estudiar si la protección que encontremos está asociada a la preservación de la función mitocondrial y de la actividad de enzimas antioxidantes ya que frecuentemente se ha encontrado que el daño oxidante está asociado a alteraciones en la función mitocondrial y a la disminución de enzimas antioxidantes. Trataremos de contestar la pregunta si la protección es mediada por una acción antioxidante directa, indirecta o bifuncional. Esto lo haremos al medir no solo la actividad sino también la expresión de las enzimas antioxidantes. Por ejemplo si la administración o exposición al antioxidante induce protección asociada al aumento en la expresión de las enzimas a nivel de la cantidad de proteína y de ARNm dependiente de Nrf2 concluiremos que dicho antioxidante está actuando también por su capacidad de inducir enzimas ciroprotectoras (antioxidante indirecto). Por el contrario, si la protección conferida por el antioxidante no se asocia a aumento en la expresión de las enzimas concluiremos que solo está ejerciendo su efecto de manera directa al atrapar especies reactivas. Además valoraremos por medio de diversos parámetros de función mitocondrial si la protección de los antioxidantes está asociada a la prevención o disminución de dichas alteraciones. En los parámetros de función mitocondrial que se evaluarán están: (a) consumo de oxígeno usando succinato y malato glutamato como sustratos y que se expresará como: estados 3 y 4, cociente respiratorio y eficiencia de la fosforilación o cociente adenosín difosfato/oxígeno; (b) actividad enzimática de los complejos mitocondriales NADH:Q oxidoreductasa (complejo I), succinato deshidrogenasa (complejo II), succinato citocromo c reductasa (complejos II y III), citocromo c oxidasa (complejo IV) y ATPasa (complejo V); (c) producción mitocondrial de ATP; (d) retención mitocondrial de calcio; (e) potencial de membrana mitocondrial; (f) producción de especies reactivas de oxígeno; (g) determinación de marcadores de estrés oxidante y (h) medición de la actividad de enzimas antioxidantes.