Los tripanosomátidos son un grupo de protozoarios que producen enfermedades graves en regiones tropicales de casi todo el mundo. En el grupo se incluye a Leishmania spp., agente causal de la leishmaniasis y a Trypanosoma brucei, causante de la enfermedad del sueño. Además de su relevancia médica, estos parásitos son importantes por presentar mecanismos de expresión genética atípicos. Poco se sabe en tripanosomátidos sobre la transcripción de la RNA Polimerasa III (Pol III), la cual sintetiza varios tipos de moléculas de RNA pequeñas que juegan papeles críticos en el metabolismo celular, como RNAs de transferencia (RNAt) y el RNA ribosomal (rRNA) 5S. El tRNA-Sec se encarga de incorporar selenocisteína (el aminoácido 21) a un grupo de proteínas esenciales llamadas selenoproteínas, mientras que el rRNA 5S es un constituyente estructural del ribosoma, por lo que también lleva a cabo un papel esencial en la síntesis de proteínas. Debido a la importancia que tiene estas moléculas de RNA, estamos interesados en estudiarlas en los tripanosomátidos. En vertebrados se requiere principalmente de tres factores de transcripción para que Pol III inicie la transcripción: TFIIIA, TFIIIB y TFIIIC. Recientemente se identificó a la proteína Maf1, la cual funciona como regulador negativo de la actividad de Pol III. De estas proteínas, sólo TFIIIB (formado por las subunidades BRF1, Bdp1 y TBP) y Maf1 han sido identificados en tripanosomátidos. Así, el objetivo principal de este proyecto es el de estudiar diversos aspectos de la transcripción de Pol III en L. major y T. brucei. Los objetivos específicos son: [1] Caracterizar molecularmente el rRNA 5S. Se localizarán los sitios de inicio y término de la transcripción de los genes del RNAr 5S en L. major mediante ensayos 5’ y 3’-RACE. La unión específica de proteínas nucleares al gen se analizará mediante geles de retardo. La purificación e identificación de dichas proteínas se llevará a cabo mediante ensayos de DNA pull-down. [2] Estudiar la transcripción del tRNA-Sec. Por medio de experimentos de run-on nuclear llevados a cabo con células irradiadas con luz UV se determinará si el gen de tRNA-Sec de L. major contiene su propia región promotora o si es transcrito como parte de un policistrón. Ensayos en presencia de inhibidores específicos revelarán la identidad de la RNA polimerasa que transcribe el gen. Asimismo, se determinará la estructura nucleosomal del gen de tRNA-Sec y se comparará con la de genes sintetizados por Pol II y por Pol III. Mediante ensayos ChIP de determinará si Pol III se une al gen del tRNA-Sec de L. major. [3] Caracterizar funcionalmente factores de transcripción de Pol III. Se estudiarán BRF1 (subunidad de TFIIIB) y Maf1, represor de la transcripción de Pol III. Para ello, se generarán líneas celulares en las que se induzca el knock-down de BRF1 y Maf1 mediante RNA de interferencia. Se analizarán los efectos de los knock-downs de las 2 proteínas en el crecimiento celular, por medio de curvas de crecimiento. Posteriormente, se determinarán los efectos de los knock-downs en la abundancia de moléculas de RNA sintetizadas por las tres RNA polimerasas, mediante ensayos de run-on nuclear. Estos experimentos se llevarán a cabo únicamente en T. brucei, debido a que en L. major no funcionan los knock-downs por RNAi. De forma paralela se estudiarán dos proteínas que contienen dedos de zinc, TbZ5 y TbZ4, y que son los probables ortólogos de TFIIIA. _x000D_ _x000D_

Los tripanosomátidos constituyen un grupo de protozoarios parásitos de importancia médica, pues producen enfermedades que tienen un gran impacto en la salud de millones de personas en áreas tropicales y subtropicales del mundo. Además, directa o indirectamente tienen un impacto económico cuantioso, al considerar todos los aspectos monetarios relacionados con la enfermedad y muerte que producen en humanos y también en ganado. Además de la importancia médica y económica, los tripanosomátidos son importantes desde el punto de vista molecular, pues presentan mecanismos de expresión genética muy diferentes a los presentes en otros organismos eucariontes. Entre éstos se incluye la transcripción policistrónica, el trans-splicing y la edición de los transcritos mitocondriales. Poco se sabe en estos parásitos sobre la transcripción de Pol III, la cual sintetiza varios tipos de moléculas de RNA pequeñas esenciales que juegan papeles críticos en el metabolismo celular. A pesar de la importancia de dichas moléculas de RNA, no se ha reportado la caracterización de ningún promotor tipo Pol III en Leishmania. La caracterización de los transcritos del rRNA 5S y del tRNA-Sec aumentará substancialmente nuestro entendimiento de los procesos transcripcionales en los parásitos tripanosomátidos. Además, el estudio del tRNA-Sec aportará datos que nos permitirán entender mejor el muy interesante mecanismo de síntesis de selenoproteínas en este grupo de parásito. Asimismo, algunos de nuestros experimentos están dirigidos hacia identificación y caracterización de proteínas involucradas en la transcripción de Pol III en Trypanosoma brucei. Este organismo presenta la vía del RNA de interferencia (RNAi) (ausente en L. major), herramienta muy efectiva para el silenciamiento y análisis funcional de genes. Se espera que los resultados que se obtengan en el presente proyecto constituyan un avance significativo en esta importante área de la parasitología molecular.