Para evitar la endogamia un número importante de especies desarrollaron un mecanismo genético-bioquímico de reconocimiento y rechazo del polen propio, conocido como sistema de autoincompatibilidad (AI). En Solanaceae la AI está controlada genéticamente por un locus multialélico (locus S) que incluye 2 genes fuertemente ligados. Uno de ellos codifica la determinante masculina (SLF) con expresión específica del polen y el otro gen codifica a la femenina (S-RNasa) con expresión exclusiva del pistilo. El rechazo del polen ocurre si hay coincidencia alélica entre el haplotipo S de polen con alguno de los haplotipos S del pistilo. Además de las determinantes de especificidad, en la AI se requiere de los productos de otros factores no ligados al locus S, llamados genes modificadores (GM)._x000D_ En nuestro grupo clonamos el GM NaStEP de N. alata. Este gen codifica una proteína de 24.4 kD con homología a los inhibidores de proteasas de tipo Kunitz. NaStEP se expresa solo en los estigmas maduros de las especies AI de Nicotiana. Estudios de pérdida de función en híbridos transgénicos de Nicotiana con NaStEP suprimida, indican que en su ausencia se pierde la capacidad de rechazar el polen de manera haplotipo S-específica, demostrando que NaStEP es un gen esencial para la AI. A pesar de la relevancia de estos datos desconocemos el mecanismo bioquímico de NaStEP en el rechazo del polen en Nicotiana. Una propuesta es que lo haga mediante interacciones con proteínas del tubo polínico. En congruencia con esta hipótesis, experimentos de interacción proteína-proteína nos permitieron encontrar que NaStEP interactúa, al menos en levaduras, con una proteína específica del polen (C12Y21). No obstante, a la fecha desconocemos si esta interacción es funcional en el rechazo del polen, por lo que uno de los objetivos de este proyecto será: Determinar si la interacción física entre NaStEP y C12Y21 es uno de los eventos esenciales en la vía del rechazo del polen en Nicotiana._x000D_ Por otra parte, tenemos evidencia genética que otro GM estilar (el factor 4936), es esencial en el rechazo del polen en N. alata. En un intento por clonar este gen, se realizaron substracciones de bibliotecas de cDNA de plantas AC y AI, de las cuales identificamos al gen NaPEP II que tiene una expresión específica en el estilo maduro de plantas. Sin embargo, no tenemos evidencia funcional de que NaPEP II sea un GM esencial en la AI. De esta manera, otro de los objetivos centrales del proyecto será: Determinar si NaPEP II es el factor 4936 mutado en las plantas AI de N. alata, o en su defecto, determinar si este gen es esencial para el reconocimiento y rechazo del polen._x000D_ Estos objetivos serán abordados mediante experimentos de pérdida y ganancia de función en plantas transgénicas de Nicotiana. Además, para evaluar las interacciones proteína-proteína en un sistema de células vegetales, se realizarán experimentos de complementación biomolecular de la fluorescencia (BiFC). La localización subcelular de C12Y21 y PEP II se hará por técnicas de inmunolocalización y microscopia confocal._x000D_ Los resultados derivados de esta investigación impactarán en el área de la reproducción sexual en plantas, en particular, en el campo de la AI. Su importancia será mayúscula, ya que estaremos aportando información clave que contribuirá de manera contundente a elaborar un modelo más completo sobre el mecanismo bioquímico que opera en el rechazo del polen en especies con sistemas de AI basados en S-RNasas._x000D_

Los modelos que tratan de explicar el rechazo del polen en sistemas basados en S-RNasa reflejan sin duda los logros actuales en el entendimiento del mecanismo molecular del rechazo del polen. Sin embargo, la información molecular vertida en ambos casos deja muchas incógnitas por resolver, lo que es resultado del desconocimiento de otros genes modificadores (GM) tanto del pistilo como del polen que completan esta vía. _x000D_ En particular, en nuestro grupo somos partidarios del modelo de compartamentalización de las S-RNasas, en el cual fuimos copartícipes de los datos que condujeron a su postulación en 1996 por Goldraij et al. Por lo que desde ese tiempo hemos enfocado nuestros esfuerzos a identificar y clonar los GMs estilares que sean esenciales en la vía bioquímica del rechazo del polen en Nicotiana. Este trabajo nos llevó a identificar el gen estigmático NaStEP (Busot et al., 2008) y comprobamos mediante experimentos de pérdida de función que es esencial en la respuesta del rechazo del polen en Nicotiana. Además, encontramos que NaStEP es un estabilizador positivo de la proteína HT-B en TPs (Jiménez-Durán et al., sometido). Asimismo, encontramos que la proteína NaStEP interactúa físicamente con un proteína (C12Y21) específica del polen (García-Valencia, no publicado). _x000D_ También nuestro trabajo ha estado dirigido en clonar en Nicotiana el gen que codifica el factor 4936. Para este fin generamos una población recombinante F2 (11613) Esta población fue generada por la cruza de una mutante auto-compatible (AC) de N. alata con una plata auto-incompatible (AI) de N. alata. Como resultado de esta cruza el 100 % de la generación F1 fue AI, indicando que el defecto en la mutante AC es recesivo. Para generar una población segregante, una planta de la progenie F1 (donadora de polen) se retro-cruzó con al mutante AC original (madre). La progenie derivada (población 11613) de esta cruza segregó en 75% de plantas AI y 25% de AC. Esta proporción fenotípica se ajusta al modelo de dos loci con funciones redundantes. De esta manera, proponemos que en la mutante AC de N. alata dos genes con funciones redundantes están afectados. Al factor afectado se le llamó 4936. Para clonar este factor de las plantas AI de la población 11613, Busot (2009), realizó una serie de hibridaciones substractivas entre bibliotecas de cDNA de estilos de plantas AC y AI de la población 011613. Así, se identificó al gen NaPEP II (proteína II expresada en el pistilo de N. alata), el cual define una familia de tres miembros o clases diferentes: NaPEP IIA, NaPEP IIB y NaPEP IIC. El cDNA NaPEP II fue recuperado 45 veces de las bibliotecas de cDNA. Las clases A, B y C de NaPEP II fueron recuperadas de las bibliotecas 25, 12 y 6 veces, respectivamente, distribuyéndose las secuencias de la siguiente forma: Clase A: 12 secuencias provenientes de la biblioteca AC y 13 de la biblioteca AI. Clase B: 12 secuencias provenientes de la biblioteca AI y cero de la biblioteca AC. Clase C: 3 secuencias provenientes de la biblioteca AC y 3 provenientes de la biblioteca AI. De esta manera, el mejor candidato para ser el factor 4936 es NaPEPII-clase B (NaPEPIIB), ya que este mRNA solo se recuperó de la biblioteca de estilos AI y su ausencia puede ser la responsable del fenotipo de AC en la planta mutante de N. alata. La identidad de secuencia nucleotídica entre las clases A y B, A y C y B y C de NaPEP II es de 98.2 %, 94.3 % y 94.2 %, respectivamente. _x000D_ Las proteínas de las tres clases contienen una región rica en asparagina hacia el extremo carboxilo y muestran homología con inhibidores de metil-esterasas de pectina (PME). Los isogenes NaPEP II se expresan solamente en los estilos y estigmas maduros._x000D_ Sin embargo, a pesar de estos importantes avances, aún quedan preguntas por resolver como: ¿La interacción NaStEP-C12Y21 evita que la proteína HT-B se degrade en los TPs incompatibles? ¿La proteína NaStEP solo interactúa con la proteína del polen C12Y21? ¿El gen C12Y21 es esencial para el rechazo del polen en Nicotiana? ¿Es el gen NaPEP II el factor 4936 mutado en las plantas AC de N. alata? ¿Es el gen NaPEP II esencial para el rechazo del polen en N. alata? ¿La proteína NaPEP II ingresa a los TPs? ¿Tiene la proteína de NaPEP II actividad de inhibidor de PEM?_x000D_ Por lo tanto, si en este proyecto que se está proponiendo se logran resolver todas estas interrogantes, la contribución en el área de la reproducción sexual en plantas, en particular del campo de la AI, será mayúscula, ya que estaremos aportando información clave que contribuirá de manera contundente a elaborar un modelo más completo del mecanismo bioquímico que opera en el rechazo del polen en sistemas basados en S-RNasas._x000D_