El pirofosfato inorgánico (PPi) se considera un subproducto de la biosíntesis y su hidrólisis es necesaria para impedir que las reacciones de síntesis de DNA, RNA y proteínas se reviertan por efecto de la ley de acción de masas. Sin embargo, en las plantas, diversas evidencias muestran que el PPi tiene otras funciones relacionadas con el crecimiento y la adaptación a condiciones de estrés. Entre otros aspectos, las plantas presentan múltiples hidrolasas específicas para PPi y se ha observado que la sobreexpresión de las pirofosfatasas vacuolares (PPv), que son además bombas de protones, incrementa la tolerancia a ciertos tipos de estrés. En el laboratorio, se ha estudiado el efecto de eliminar los genes de las pirofosfatasas inorgánicas solubles (PPa) 1, 4 y 5 y se ha observado que las plantas muestras fenotipos alterados de crecimiento lento y mayor tolerancia al estrés. En dos de estas mutantes se ha estudiado la expresión génica por medio de microarreglos y se han encontrado múltiples cambios, entre los cuales se han identificado diversas proteínas vinculadas a la respuesta a condiciones de estrés. Sin embargo, no sabemos si esta expresión modificada se mantiene o no cuando la planta mutante se somete a estrés. En el presente proyecto se propone profundizar el estudio de la relación entre la expresión y la actividad de las PPa y las PPv con la tolerancia de las plantas a las condiciones de estrés empleando varias estrategias: i) Estudiar la posible asociación de las PPa citoplásmicas con otras proteínas y/o estructuras subcelulares mediante microscopia confocal, microscopia electrónica y fraccionamiento celular. ii) Profundizar en el estudio de la expresión de estas proteína bajo condiciones de estrés, utilizando mutantes que carecen de alguno de los genes. iii) Estudiar la expresión de genes específicos vinculados al estrés e identificados en los microarreglos mediante las técnicas de RT-PCR, PCR-tiempo real y Western-Blot. iv) Investigar las variaciones en la expresión de otros genes de respuesta a estrés asociados a la interrupción de genes individuales de pirofosfatasas, en plantas mutantes. v) Continuar la caracterización molecular de las proteínas expresadas in vitro como formas recombinantes y a través de los cambios en su actividad in vivo. vi) Determinar si la sobreexpresión de la pirofosfatasa vacuolar (PPv) es capaz de compensar, total o parcialmente la carencia de alguna pirofosfatasas soluble (PPa) y estudiar los cambios en la expresión genética de genes asociados a estrés, previamente identificados como relevantes, en el trabajo anterior.

La comprensión de los mecanismos mediante los que se regula tanto la expresón como la actividad de las pirofosfatasas inorgánicas en el metabolismo vegetal, va mucho más allá de una cuestión de mero interés científico. Las plantas cultivables están inevitablemente sujetas a estrés ambiental en el campo y entre menos tecnificada está la agricultura, dichas condiciones de estrés tienen un impacto más negativo en la productividad agrícola. Por ello, con miras a un futuro con menos áreas cultivables y mayor demanda de alimentos es necesario entender mejor el metabolismo y la regulación del crecimiento vegetal a fin de agilizar la obtención de variedades vegetales mejor adaptadas a las condiciones ambientales adversas, condiciones que además varían entre los diversos emplazamientos agrícolas del país. Aún si la tendencia a limitar el uso de plantas transgénicas se mantiene, habremos de requerir métodos eficientes de selección de variedades bien adapatadas a cada región agrícola y, para ello, hace falta el conocer los marcadores moleculares que están asociados a cada respuesta de adaptación. Sólo así es posible saber que genotipo buscar y como hallarlo rápidamente dentro de la población. El presente proyecto busca profundizar lo aprendido en los proyectos precedentes en lo referente a: -La ubicación subcelular fina de las Pirofosfatasas inorgánicas solubles y sus interactores. -La regulación de la expresión de estas proteínas bajo condiciones de estrés. -Su relación con otros sistemas de genes de respuesta al estrés. -La regulación de su actividad in vitro vs. in vivo y, finalmente, -La relación entre las pirofosfatasas solubles y la pirofosfatas vacuolar en condiciones de estrés.