Bacterias llamadas rizobias realizan la reducción de nitrógeno atmosférico a amonio en una asociación simbiótica con plantas leguminosas. En Sinorhizobium meliloti, el microsimbionte de la alfalfa, la habilidad de síntetizar la L-ornitina es necesaria para el desarrallo de una simbiosis efectiva. La ornitina es un precursor de la biosíntesis de las poliaminas. Proponemos que en S. meliloti los defectos simbioticos en cepas auxótrofas de ornitina radica su capacidad disminuida para síntetizar estos compuestos. Las poliaminas son moléculas policatiónicas con dos o más grupos amino que tienen multiples funciones fisiologicas, incluyendo papeles como la replicación, transcripción, traducción y la resistencia al estrés, tanto en procariotes como en eucariotes. Ejemplos incluyen la diamina putrescina y las triaminas cadaverina, espermidina y homoespermidina. Se creé que las poliaminas juegan un papel fisiologíco en la simbiósis rizobia-leguminosa, pero sabemos muy poco sobre sus funciónes, rutas de biosíntesis y catabolismo, transporte o regulación. Nuestro objectivo en el presente proyecto es abordar estos temas utilizando el organismo modelo S. meliloti 1021. Basado en la secuencia genómica de la cepa 1021, hemos predecido los genes que codifican enzimas involucradas en la biosíntesis y catabolismo de las poliaminas o forman sistemas para su transporte. Nuestros objetivos experimentales son: 1. Determinar como las condiciones del crecimiento en cultivo, por ejemplo el estrés ácido o la microaeróbiosis, afectan los tipos y cantidades de poliaminas intracélares producidas. El análisis de poliaminas también será realizado en bacteroides obtenidos de nódulos de alfalfa. El logro de este objectivo implica la extracción de las poliaminas de céulas, su derivitización quimica, su identifición y cuantifición por medio de la cromatografía líquida de alta resolución y por cromatografía en capa fina. Los resultados proporcionán un indicio sobre cuales vías biosínteticas predichas son funcionales. Esta estretegía también podría detectar especies de poliaminas inesperadas que son síntetizadas por vías no predichas. 2. Establecer la manera en la cual la expresión de genes involucrados en el metabolismo y transporte de las poliaminas cambia bajo diferentes condiciones de crecimiento (vida libre y simbiosis). La cuantificación transcripcional de los genes será realizado por medio de fusiones con el gen reportero beta-glucuronidasa. Los datos obtenidos nos proporcionarán una vista de como las condiciones ambientales afectan la expresión de los genes involucrados en las vías del metabolismo o el tranporte de las poliaminas. 3. Determinar los efectos fenotípicos de la inactivación de genes para el metabolismo y transporte de poliaminas en vida libre y en simbiosis. Las mutantes en uno o más un genes selecionados será construido por la mutagenesis dirigida. El perfil de poliaminas producidas y ensayos relevantes de actividad enzimática o de transporte serán determinadas en las mutantes. Los fenotípos en cuanto el crecimiento serán probados bajo diversas condiciones en cultivo y en simbiosis. Los datos obtenidos por este análisis nos dará información sobre la importancia fisiológico y posibles funciones de las poliaminas en S. meliloti. El logro de los objectivos del proyecto propuesto utilizando este modelo de estudio será una contribución fundamental a nuestros conocimientos sobre el metabolismo y función de las poliaminas en este grupo de bacterias ecológicamente importante.

El conocimiento básico generado por los estudios del metabolismo en bacterias simbioticas fijadoras de nitrógeno ha sido importante en dos formas generales. La primera es en establecer la base molecular de esta interacción ecológicamente y agronómicamente vital, proporcionando una comprensión (aun no completa) sobre los modos del metabolismo y su regulación en los microsimbiontes en vida libre y en simbiosis. Aunque el metabolismo de las rizobias en simbiosis es fuertamente vinculado al metabolismo de la huésped (leguminosa), los estudios del metabolismo en los microsimbiontes continúa dando información vital para la comprensión de esta interacción mutualista. Otro enfoce importante es la aplicación de los conocimentos básicos para mejorar la eficiencia de la fijación del nitrógeno en la interacción rizobia-leguminosa, y su posible extensión a plantas no leguminosas (7, 22). Las poliaminas tienen un papel fundamental en el desarollo y la fisiología de casi todos los organismos vivos. Estos compuestos tienen un lugar importante en la investigación básica y aplicada debido a su papel clave, pero aun no esta bien definido, ya que esta involucrado en muchos procesos que van desde su habilidad para estabilizar el DNA hasta su participación en el desarrollo de enfermedades en los organismos superiores. Como es descrito el los antecedentes, las poliaminas estan hipótesizadas en jugar un papel en el desarrralo y funcionamento de la simbiósis rizobia-leguminosa. Sin embargo, nuestro conocimeinto sobre su metabolismo (biosíntesis, catabolismo y transporte) en las rizobias es limitado principalmente a dos areas: (i). Predicción de los posibles vías que existen en diferentes especies inferidas por un análisis computacional de secuencias genómicas y (ii). Evidencias de cambios en la expresión de algunos componentes predichos de las vías del metabolismo de poliaminas han sido obtenidos por medio de estudios de transcriptómica o proteómica. En suma, estos datos muestran una gran variadad de posibles vías para el metabolismo de las poliaminas en rizobias que cambian su expresión bajo diversas condiciones de crecimiento (vida libre y simbiosis). El proyecto propuesta pretende usar la genómica funcional para proporcionar datos experimentales sobre el metabolismo, transporte e importancia fisiológica de las poliaminas en el microsimbionte modelo Sinorhizobium meliloti 1021. Los datos obtenidos constituirán un avance importante en la confirmación experimental de las vías predichas en S. meliloti (y por extensión en otras rizobias), el posible descubrimiento de vías no predichas, y una primera indicación de la importancia de las poliaminas en la fisiología de S. meliloti en vida libre y en simbiosis. El proyecto propuesto será la única caracterización exhaustiva y sistemática del metabolismo y función de estos importantes compuestos en las rizobias. Los resultados del proyecto propuesto podrián contestar (en algunos casos solo parcialmente) varias preguntas y confirmar o rechazar algunos hipótesis, incluyendo: (i) ¿Hay un papel importante para la síntesis, catabolismo y/o transporte de las poliaminas en vida libre y/o en simbiosis? (ii) ¿Es cierto que los defectos simbioticos de los auxótrofos de ornithina de S. meliloti son debidos a sus deficiencias en la biosíntesis de las poliaminas? (iii). ¿Es posible que las poliaminas de diferentes clases químicas (diaminas versus triaminas, por ejemplo) funcionen de una manera intercambiable, o hay poliaminas específicas para papeles fisiológicos específicos? ¿ Si las diferentes poliaminas tienen funcciones similares y redundantes, por que hay una multitud de vías biosínteticas para producir diferentes poliaminas? (iv) ¿Cual es la especificidad y posibles funciones fisiologicas de los transportadores de poliaminas? Uno de las perspectivas a corto plazo del proyecto propuesto será el uso de los datos obtenidos para abordar experimentos para determinar los mechanismos de regulación de los genes involucrados en el metabolismo y transporte de las poliaminas. Los primeros experimentos consistirían en determinar la expresión de las cepas que contienen las fusiones transcripcionales en fondos genéticos diferentes de S. meliloti, por ejemplo en mutantes fixJ, fixK, ntrR o hfq. Pensamos que los reguladores codificados por estos genes juegan un papel importante en la regulación directa o indirecta de genes involucradas en el metabolismo y transporte de las poliaminas en S. meliloti, como se describio en la sección de antecedentes. En forma más general, los datos generados por estudios de genómica funcional como el proyecto se propone son importante para confirmar o rechazar las funciones predichas de los genes anotados en las secuencias genómicas. La falta de conocimiento experimental sobre el metabolismo de las poliaminas en rizobias es un ejemplo específico del problema general causado por las anotaciones inciertas o equivocadas de muchas genes en las secuencias genómicas bacterianas, un problema comun que tiene consecuencias importantes para la investigación básica y aplicada. Los mejores métodos para definativamente determinar la función de un gen es clonarlo y despues expresar, purificar y caracterizar su producto, o inactivar el gen y determinar los efectos sobre el fenotípo del organismo (23, 28). Las preguntas descritas anteriormente son cuestiones básicas de la investigación microbiológica. A veces, las repuestas a cuestiones similares y aparentemente sencillas tienen repercusiones importantes y no anticipadas, como las enzimas de restricción que fueron una curiosidad en los 1960s pero hoy en día son un componente vital en la investigación básica y aplicada.