Las oxidasas multicobre (MCOs por sus siglas en ingles) son enzimas que contienen iones cobre, los cuales tienen un papel central en la catálisis de estas enzimas, interviniendo en la oxidación de diversos sustratos y generando una transferencia de electrones a un átomo de oxígeno para su conversión en agua con la adición de protones, todo esto bajo un mecanismo de reacción catalítica, que si bien ha sido profusamente estudiado en diversos sistemas, aun no se encuentra caracterizado en su totalidad. Adicionalmente, es muy común que las estructuras cristalográficas de las MCOs resulten en la pérdida, parcial o total, de ocupación en uno o varios de los iones cobre. En nuestro grupo de trabajo se ha determinado la estructura cristalográfica de la oxidasa multicobre de Thermus thermophilus (MCO-Tth) (código PDB 2XU9). Sin embargo, la exposición a los rayos X produce modificaciones específicas en la estructura: la ocupación de uno de los cuatro cobres catalíticos en esta metaloenzima, el CuT2, está particularmente afectada, inclusive en dosis de radiación absorbida muy bajas (0.7 MGy). Por lo tanto en este proyecto se pretenden explorar distintas condiciones como el uso de moléculas radioprotectoras, el uso de líneas de alta energía en fuentes sincrotrónicas, así como la atenuación en líneas estándar del flujo de rayos X. Todo lo anterior con el fin último de preservar la ocupación de los cobres en estudios cristalográficos en MCOs, particularmente del CuT2 en los cristales de la MCO-Tth. La catálisis en metaloenzimas depende de la preservación de los metales, y al escindirlos durante los experimentos de difracción de rayos X, pueden producirse cambios grandes o sutiles en la estructura que pueden conducir a conclusiones biológicas equivocadas. Una vez conseguido este objetivo pretendemos utilizar las estructuras generadas para intentar comprender de manera más amplia el mecanismo catalítico de este grupo de enzimas. Esta última posibilidad se basa en el hecho de que en nuestro laboratorio se logró describir parcialmente el mecanismo catalítico de la MCO-Tth, lo anterior utilizando solamente datos cristalográficos y controlando la dosis depositada en los cristales. Sin embargo, la temprana escisión del CuT2, debida a la susceptibilidad diferencial de los iones cobre en la MCO-Tth ante la dosis de radiación depositada y a los flujos electrónicos concomitantes limitó el análisis del mecanismo. Los resultados de este trabajo muestran la complejidad del sistema, sin embargo se puede señalar que el proceso de daño a los CuT2 y T3´ es un proceso multifactorial, el cual puede ser evitado mediante distintas estrategias; al reducir la dosis de radiación depositada a valores inferiores a 0.3 MGy, mediante colectas de datos con tiempos cortos, para así evitar el aumento en la probabilidad de daño secundario y mediante la pre-reducción del sistema de cobres con agentes reductores. También se plantea el hecho de que el sistema cristalino de la MCO-Tth pueda encontrarse protegido del daño por radiación mediante el efecto de scavenger del MPD, posibilidad que también se analizara en el presente proyecto.

En este proyecto se plantea explorar el efecto que tienen diversas estrategias con el fin de contender contra dos realidades en los experimentos de difracción de rayos X: los daños por radiación y la redicción química de las estructuras. Con esto en mente se pretende explorar el efecto de la dosis absorbida a energías de 12 keV, es decir en las condiciones en que habitualmente se difracta un cristal proteico en un sincrotrón(arriba de 10 10 fotones/seg/mm2); el efecto de la dosis acumulada en intensidades menores de rayos X, esto lo exploraremos utilizando fuentes de rayos X de ánodo rotatorio y de tubo sellado, con la idea de explorar flujos de 10 7 fotones/seg/mm2 o menores; la reducción del efecto fotoeléctrico utilizando energías de rayos X por arriba de los 30 keV, para este fin utilizaremos la línea ID 15 del ESRF en Grenoble Francia y acondicionaremos el area de trabajo para colectar difracción de monocristales; exploraremos el uso de molecular radioprotectoras con el fin de evaluar su función de absorber primero los daños por radiación generados por la exposición a los rayos X, protegiendo indirectamente al sitio activo de la MCO de Tth; y por ultimo evaluaremos el efecto que sobre las estrategias anteriores tiene la temperatura de colecta y el pH del medio cristalino. Con toda esta información contribuiremos directamente. Si bien este proyecto coordina varias estrategias con el fin de preservar la información estructural, para preservar por más tiempo y con mayor calidad la información obtenida a partir de experimentos de cristalografía, nuestro objetivo es también abrir la puerta al desarrollo de más preguntas orientadas al efecto de los rayos X en los sitios metálicos, así como del daño especifico en centros metálicos, el uso de agentes radioprotectores y distintas energías y flujos durante la colecta. Entre estas preguntas destacan: a) el papel del pH durante la colecta y su impacto en el ciclo catalítico, en la coordinación y en los centros metálicos, evaluado desde un punto de vista cristalográfico, b) el papel de los componentes de las condiciones de cristalización sobre el cristal y su posible efecto radioprotector en cristales de proteína, c) colecta de datos a distintas temperaturas con el fin de aumentar la difusión de radicales libres y poder evaluar el impacto del daño secundario, el cual es dependiente en gran medida de la temperatura y d) evaluar la coordinación y escisión de iones cobres con respecto al estado de oxidación de los mismos en cristales de la MCO-Tth. Por ultimo se pretende validar la practica de evaluar con cautela algunas estructuras del PDB depositadas, especialmente aquellas donde la dosis depositada no es indicada o aquellas estructuras que presentan puentes disulfuro o sitios metálicos, requiriendo potencialmente de una re-investigación, debido a que podrían presentar desde ligeras variaciones debidas a los daños por radiación hasta representar proteínas severamente afectadas por la exposición de los cristales a los rayos X, destacando además que se debe de tener cuidado especial al interpretar resultados biológicos o bioquímico-catalíticos cuando se parte solamente de información cristalográfica.