La citocromo c oxidasa es el último aceptor de electrones de la cadena respiratoria mitocondrial. En la levadura Saccharomyces cerevisiae se conforma de 12 subunidades; de éstas Cox1, Cox2 y Cox3 se codifican en el DNA mitocondrial. Nuestro interés es estudiar los mecanismos de regulación de la síntesis de Cox1, ya que este es el principal punto de control de la cantidad de proteína Cox1 presente en la mitocondria. Esta proteína es la subunidad más grande de la citocromo c oxidasa, presente en la membrana interna mitocondrial. Cox1 no sólo posee los sitios catalíticos para la reducción de oxígeno, sino que es el centro de nucleación alrededor del cual se ensamblan las subunidades restantes. Sabemos que la síntesis de Cox1 está acoplada al ensamblaje de la citocromo c oxidasa, e incluso a la formación de supercomplejos respiratorios. A pesar de que se han identificado diversos factores involucrados en dicha regulación, muy poco se comprende acerca de los mecanismos que regulan la traducción del mRNA de COX1. En esta propuesta queremos analizar la función de 3 proteínas que participan en la síntesis de Cox1. Dos de ellas, Pet309 y Hah1 son específicas para Cox1, mientras que Pet54 tiene una función más general sobre la síntesis de subunidades mitocondriales de la citocromo c oxidasa. Adicionalmente nos interesa analizar si la función de estas proteínas se relaciona con Mss51, proteína clave para coordinar la síntesis de Cox1 con su ensamblaje. Pet309 es un activador traduccional del mRNA de COX1 que se une al extremo 5’ no traducido del mRNA de COX1. Nos interesa analizar la función de dos dominios presentes en la proteína: la región PPR y el extremo carboxilo-terminal. De igual manera nos interesa estudiar si Pet309 se asocia al ribosoma mitocondrial y en qué condiciones se daría dicha interacción. Por otro lado, la proteína Taco1 se descubrió recientemente en mitocondrias de humano, ya que existen mutaciones en el gen que la codifica que se asocian a la patología conocida como síndrome de Leigh. Se ha propuesto que participa en la síntesis específica de Cox1, pero su mecanismo de acción es desconocido. Nosotros estudiaremos la función de su homólogo en levadura, Hah1. Este modelo nos permitirá hacer estudios de genética y bioquímica que son muy complicados de llevar a cabo en células de humano. A la par nos interesa estudiar a la proteína Pet54 como un regulador positivo de la síntesis de Cox1. Esta es una función novedosa recientemente descubierta por nuestro grupo, y que se suma a la función previamente descrita de Pet54 como activador traduccional del mRNA de COX3. La función doble de Pet54 podría sugerir que es una proteína que participa en la síntesis coordinada de ambas subunidades, lo cual podría optimizar su proceso de ensamblaje en la membrana._x000D_ _x000D_

Cox1 conforma al primer intermediario en el ensamblaje de la CcO, y alrededor de esta proteína se van reclutando el resto de subunidades de la enzima, así como los grupos prostéticos necesarios para su función (Fontanesi et al., 2008; Horan et al., 2005). Se ha observado que Cox1 mal ensamblada puede ser una fuente muy importante de producción de especies pro-oxidantes que conllevan a estrés oxidativo (Khalimonchuk et al., 2007). Esto sugiere que es muy importante para la célula controlar la cantidad de Cox1 presente en la membrana interna mitocondrial. Este control debe responder a diferentes requerimientos energéticos de la célula, así como a deficiencias en el ensamblaje de la CcO. Actualmente se reconoce que un mecanismo esencial para regular la cantidad de Cox1 en la mitocondria es a nivel de su síntesis (Fontanesi et al., 2008; Perez-Martinez et al., 2008). De hecho en años recientes se han descrito mutaciones en dos genes, LRP130 y TACO1 (cuyos homólogos en levadura son PET309 y HAH1, respectivamente), que afectan la expresión y síntesis de Cox1 y que se asocian a la patología neurodegenerativa conocida como síndrome de Leigh (Mootha et al., 2003; Weraarpachai et al., 2009)._x000D_ _x000D_ Nuestro laboratorio utilizará como modelo a la levadura S. cerevisiae, ya que en este sistema podremos realizar un estudio más detallado de los mecanismos que regulan la síntesis de Cox1. Estos estudios se podrán llevar a cabo gracias a la amplia experiencia de nuestro laboratorio en el manejo de técnicas de genética y de bioquímica de mitocondrias. Cabe mencionar que nuestro laboratorio es uno de los pocos en el mundo con la experiencia e infraestructura para hacer mutagénesis dirigida del DNA mitocondrial, herramienta invaluable para disectar los procesos que controlan la síntesis de Cox1._x000D_ _x000D_ Nuestro trabajo y el de otros ha demostrado que la síntesis de Cox1 disminuye dramáticamente cuando la CcO no se ensambla. Este mecanismo involucra la formación de un complejo de alto peso molecular (complejo COA) mediado por la misma proteína Cox1. En este complejo COA se encuentran factores necesarios para “sensar” el estado de ensamblaje de Cox1 (Barrientos et al., 2004; Khalimonchuk et al., 2010; Perez-Martinez et al., 2003; Perez-Martinez et al., 2009; Shingu-Vazquez et al., 2010). Aunque actualmente se empiezan a conocer los detalles de cómo se ensambla la CcO y de cómo el complejo COA puede “sensar” este ensamblaje, poco se comprende de cómo se lleva a cabo la traducción del mRNA de COX1, proceso que finalmente determina cuánta Cox1 se produce. En esta propuesta queremos estudiar cómo se lleva a cabo la traducción del mRNA de COX1. Para ello analizaremos la función de algunos de los factores que creemos o que se ha demostrado están involucrados en dicho proceso._x000D_ Desde 1995 se sabe que Pet309 es un activador traduccional específico para COX1 (Manthey and McEwen, 1995). Sin embargo, a la fecha no se comprende su mecanismo de acción. Pet309 pertenece a la familia de proteínas con motivos PPR. Estos motivos tienen papeles esenciales en la biogénesis de mitocondrias y cloroplastos (Small and Peeters, 2000), aunque su mecanismo de acción se desconoce. Nuestros estudios utilizando la genética y bioquímica de levadura nos han permitido comenzar a comprender su función. Esperamos por ejemplo, que mediante la caracterización de supresores respiratorios de mutantes de los motivos PPR podamos identificar nuevos factores involucrados en la función de Pet309. Este tipo de experimentos para proteínas PPR se llevarán a cabo por primera vez en nuestro modelo, ya que las proteínas PPR son más abundantes en plantas, donde el trabajo genético se dificulta más que en levadura. _x000D_ Por otro lado, recientemente nuestro grupo ha descrito una función novedosa e inesperada de la proteína Pet54 como regulador positivo de la síntesis de Cox1. Pet54 se describió originalmente como un activador traduccional específico para COX3. El hecho de que tenga una función adicional en la regulación de la síntesis de Cox1 sugiere que este proteína podría participar en la síntesis coordinada de ambas subunidades de la CcO. Nos interesa estudiar el mecanismo por el que Pet54 regula la síntesis de Cox1. Otra proteína recientemente descrita en humano es Taco1, descubierta por su asociación al síndrome de Leigh. Actualmente se comprende muy poco cuál es la función de esta proteína en humano, por lo que abordaremos su estudio utilizando al homólogo en levadura Hah1. De esta forma el uso de herramientas de genética de levadura nos permitirá obtener valiosa información de la función de Hah1. Muchos de los estudios que pretendemos abordar en esta propuesta son muy difíciles de llevar a cabo en cultivos de células humanas._x000D_ En esta propuesta nos interesa analizar si la función de las proteínas descritas anteriormente tiene relación con Mss51, la cual es central para el acoplamiento entre la síntesis de Cox1 y el ensamblaje de la CcO. Es interesante que a pesar de los múltiples estudios de Mss51 como chaperona de ensamblaje de la CcO, muy poco se conoce de su función en la activación traduccional del mRNA de COX1. _x000D_