Azotobacter vinelandii, una bacteria del suelo filogenéticamente relacionada a Pseudomonas spp, produce un polisacárido extracelular llamado alginato el cual posee aplicaciones muy importantes en el área industrial y en el área de medicina y cultivo de tejidos. Actualmente estamos interesados en conocer la genética y la regulación de la síntesis de alginato en esta bacteria debido al interés de producir alginatos vía fermentación bacteriana con características Fisicoquímicas definidas. Uno de las propiedades mas atractivas del alginato es su capacidad de formar soluciones viscosas, lo que depende en gran medida del peso molecular del polímero. En el laboratorio identificamos una mutante Tn5 que exhibe un incremento tanto en el peso molecular (PM) como en la producción específica de alginato. El análisis de la secuencia del locus afectado demostró que en esta mutante el Tn5 interrumpió un gen (Avin07910) cuyo producto es una proteína transmembranal sensora que posee dominios tanto de síntesis (GGDEF) como de degradación (EAL) de c-di-GMP y la hemos llamado MucG. MucG también posee un dominio PAS sensor de oxígeno. El c-di-GMP es un segundo mensajero implicado en una gran variedad de procesos celulares bacterianos como motilidad, formación de biofilm y producción de polímeros. Anteriormente ya se había demostrado que el c-di-GMP es esencial para la producción de alginato en especies de Pseudomonas y que la co-polimerasa Alg44 une esta molécula señal y, tras esa unión, regula la actividad polimerizante de Alg8. Debido a que MucG posee un efecto negativo sobre la producción de alginato en A. vinelandii y debido a la presencia del dominio de degradación de c-di-GMP, nuestra hipótesis de trabajo es que MucG controla la degradación del c-di-GMP regulando así la producción de alginato a nivel de su polimerización. Además, debido a que el PM del alginato sintetizado en A. vinelndii responde a las concentraciones de oxígeno es probable que MucG sea un intermediario en esta cascada de señalización. La caracterización de un regulador, como MucG, de la producción de alginato y de su PM no tiene precedente. En este proyecto nos hemos propuesto identificar el mecanismo molecular de este proceso. En este contexto se evaluará el efecto de MucG sobre la expresión de genes biosintéticos alg, en especial de aquellos que codifican el complejo polimerasa en A. vinelandii. Además se investigará si MucG posee un efecto sobre enzimas con actividad alginato liasa las cuales se ha comprobado determinan en gran medida el PM del alginato. Para investigar si los dominios GGDEF y EAL son funcionales y necesarios para la regulación de la síntesis de alginato construiremos cepas derivadas que porten mutaciones en el gen mucG y que tengan mutado estos dominios de síntesis o de degradación de c-di-GMP. Estas cepas derivadas también se caracterizaran en cuanto a su producción de alginato y el efecto en el PM del alginato producido. Este trabajo abre la posibilidad de entender mejor el proceso de polimerización/degradación de este polímero en A. vinelandii una de las etapas mas pobremente estudiadas de esta ruta biosintética.

Los alginatos algales son muy pobres respecto a su pureza y la consistencia del polímero. Frecuentemente están contaminados con proteínas y otros compuestos inmunogénicos que requieren un extensivo proceso de purificación. El potencial para los alginatos bacterianos es producir un polímero con propiedades materiales definidas para aplicaciones de alto valor. Tal es el caso en las áreas médicas, farmacéuticas y de ingeniería de tejidos. Esto se puede lograr mediante un mejor entendimiento de los procesos de polimerización, modificación y regulación de la síntesis de alginato en A. vinelandii y de la optimización de las condiciones de cultivo. La identificación de una proteína reguladora como MucG que afecta el peso molecular de alginatos bacterianos no tiene precedente ni en Azotobacter ni en Pseudomonas spp. Por lo tanto la caracterización del mecanismo molecular por el que MucG afecta tanto la producción específica de alginato, y su peso molecular, abre la posibilidad de entender mejor el proceso de polimerización/degradación de este polímero en A. vinelandii. En este punto surge la necesidad de investigar cual proceso es el que afecta la proteína sensora MucG y que podrian ser: i) el grado de polimerización del alginato al afectar la actividad de Alg44 y por ende de Alg8; ii) el grado de degradación del mismo al controlar la actividad de alginatos-liasas: iii) el grado de expresión de genes biosintéticos de alginato.