La degradación regulada de proteínas por el sistema ubicuitina/proteasoma (SUP) es un mecanismo empleado por los organismos eucariontes para regular un a gran variedad de procesos de desarrollo y de respuesta a condiciones medioambientales. Este proceso ocurre en dos pasos, inicialmente la proteína a ser degradada es modificada mediante la adición de al menos cuatro moléculas de una proteína de 76 aminoácidos denominada ubicuitina. La adición de esta última requiere de su activación y del reconocimiento de la proteína que será degradada, dicho reconocimiento es mediado por una ligasa de ubicuitina o E3. Después de que la proteína ha sido ubicuitinada, ésta es reconocida y degradada por el proteasoma 26S, éste es un complejo de proteínas que está formado de un subcomplejo catalítico (20S) y otro regulatorio (19S). La regulación del SUP requiere de la interacción de los distintos complejos con otras proteínas, esto ocurre tanto a nivel del proceso de ubicuitinación como a nivel del de degradación.
Debido a la importancia de las E3 como elemento reclutador de la proteína a ubicuitinarse, en nuestro grupo nos hemos interesado en el estudio de moléculas con esta función involucradas en la respuesta a estrés en plantas superiores. En los último años, hemos caracterizado a una proteína con caja F de Arabidopsis thaliana, denominada AtFBS1, la cual es parte del complejo de ligasa de ubicuitina SCF. El mensajero de esta proteína se acumula en diversas situaciones de estrés en plantas de Arabidopsis. En la búsqueda de los posibles sustratos de AtFBS1, encontramos que esta proteína interactúa en un sistema de doble híbrido de levadura con proteínas 14-3-3 , con HSP23 y con transducina. Sin embargo, no hemos podido demostrar in vivo esta interacción. Por tanto, en este proyecto planteamos nuevas estrategias para tratar de identificar sustratos de las E3 de esta familia. Por un lado, utilizaremos sólo el C-terminal de AtFBS1 pues es estable y soluble para intentar analizar interacciones con otras proteínas. También emplearemos AtFBS2 y AtFBS4 que igualmente son proteínas estables y nos podrían permitir la búsqueda de sustratos. Por otra parte, queremos analizar el fenotipo de plantas mutantes en los 4 miembros de la familia AtFBS con el fin de asignar una función a estas proteínas. Para tener una idea más completa del papel del SUP en la respuesta al estrés intentaremos identificar otras E3 que participen en la respuesta a estrés en A. thaliana e iniciaremos su caracterización.
Por otra parte, continuaremos con la búsqueda de proteínas que interactúen con el proteasoma en condiciones de estrés. Igualmente, intentaremos un análisis estructural del proteasoma utilizando microscopía electrónica, con el fin de buscar diferencias entre proteasomas de plantas crecidas en condiciones normales y plantas sujetas a estrés. El análisis se complementará con la determinación de los componentes de cada uno de ellos por espectrometría de masas. Esta última parte del trabajo se realizará en el laboratorio del Dr.José María Valpuesta del Centro Nacional de Biotecnología en Madrid, España.

Los fenómenos de proteólisis son parte esencial en la maquinaria de regulación de múltiples procesos en los organismos eucariontes. Dos de estos sistemas han concentrado la atención de nuestro grupo debido al papel que tienen en las respuestas al estrés en plantas: el sistema ubicuitina/proteasoma y las metacaspasas.
En las plantas el SUP parece tener una gran importancia ya que del genoma de Arabidopsis thaliana aproximadamente el 5% codifica para proteínas que participan de alguna manera en el éste. En nuestro grupo nos hemos interesado de un tiempo a la fecha en el papel del SUP en la regulación de los procesos que le permiten a las plantas contender con situaciones adversas. Nuestro estudio se inició con la caracterización de la proteína AtFBS1 la cual es componente de un complejo de ligasa de ubicuitina del tipo SCF, y que con base en el patrón de acumulación de su mensajero, hemos postulado que participa en las respuestas de Arabidopsis a varios tipos de estrés como el osmótico, la salinidad, la herida y la infección por patógenos. La importancia de las ligasas de ubicuitina es que son el componente del sistema de ubicuitinación responsable de seleccionar al sustrato. Hemos encontrado además que AtFBS1 interactúa con proteínas 14-3-3, transducina y HSP23-Ahora quisiéramos extender nuestro conocimiento acerca del papel que desempeña el SUP en la respuesta de defensa de la planta ante situaciones de agobio, a través de la identificación de nuevos factores que modulen su actividad. Este proyecto esta dividido en dos partes claramente relacionadas.
En la primera parte del proyecto continuaremos el estudio de AtFBS1 y de las proteínas que guardan semejanza con ésta a las cuales hemos denominado AtFBS2, 3 y 4. Se continuará con el análisis de proteínas interactoras, tano de las ya conocidas, como en la búsqueda de nuevos blancos. Nosotros suponemos que el blanco o blancos de esta proteína deben de ser reguladores negativos del sistema de respuesta al estrés en Arabidopsis y en general en plantas superiores, por lo mismo la identificación de estos permitirá sin lugar a dudas, un mejor conocimiento de los mecanismos empleados por las plantas para contender con el estrés.
Adicionalmente en este proyecto planteamos el análisis de nuevas ligasas de ubicuitina seleccionadas con los siguientes criterios: que sus mensajeros se acumulen en respuesta a estrés y que sean proteínas suficientemente estables para permitir una caracterización bioquímica. Como se mencionó arriba, las ligasas de ubicuitina seleccionan la proteína a ser ubicuitinada, por lo mismo el análisis de estas permitirá identificar los factores y mecanismos moleculares que participen en la respuesta al estrés en plantas y por lo mismo, además de la adquisición de conocimiento, hará factible el diseño de estrategias para la generación de plantas con mejores características.
En la segunda parte de este proyecto, nos proponemos continuar con la identificación de proteínas cuya asociación al proteasoma ocurra bajo condiciones de estrés, estas proteínas deberían de ser o bien sustratos del SUP o bien proteínas que modulen la actividad o la especificidad del proteasoma en estas condiciones. En ambos casos estaríamos identificando proteínas cuya función estaría involucrada en la defensa de las plantas ante medios ambientes desfavorables. Esto evidentemente sería una contribución al conocimiento de los mecanismos que emplean las plantas para contender con situaciones de estrés. La idea de este proyecto no es sólo producir una lista de nuevos elementos que se asocian al SUP en condiciones de estrés, sino también entender el papel de los nuevos elementos que se detecten mediante el análisis sistemático de las muestras. El estudio de la regulación de las PAPs, la localización intracelular de la mismas, así como el estudio del fenotipo que resulte de la deleción y de la sobreexpresión de las nuevas PAPs, nos ayudará a entender el papel fisiológico del nuevo componente.
Muchas de las PAPs hasta ahora descritas pertenecen a grupos de función ciertamente divergente, la función conocida de algunas de ellas, en el marco de la degradación de las proteínas mediada por el sistema de la ubicuitina-proteasoma, esta aún muy lejos de ser entendida. Una posibilidad es que el o los diferentes elementos que interaccionan con una PAP específica, además del proteasoma por supuesto, no han sido aun descritos. La producción de mapas de interacción proteína-proteína que interrelacionen las diferentes PAPs con otros componentes y sistemas celulares es el objetivo final de esta parte del proyecto.
Una estrategia ampliamente usada para producir los mapas de interacción proteína-proteína, además del sistema de doble híbrido en la levadura, es el uso de proteínas “etiquetadas” (tagging approach) que permite usar una proteína relevante como “carnada”. Mediante la purificación por inmunoafinidad del complejo PAP-proteína que interacciona con la PAP, en combinación con las técnicas de caracterización molecular arriba mencionadas, podremos identificar directamente complejos proteicos a escala proteómica. Validaremos la interacción de las proteínas por medio de inmunoprecipitaciones recíprocas y la co-expresión de las proteínas involucradas e inmunoprecipitación. La diversidad en las conformaciones del proteasoma y de su composición es un campo de investigación que apenas comienza. El estudio de las PAPs, sin duda abrirá nuevas perspectivas sobre la dinámica del proteasoma.
Adicionalmente nos hemos planteado también el llevar a cabo un estudio estructural del proteasoma. Datos preliminares obtenidos en el laboratorio del Dr. José María Valpuesta del Centro Nacional de Biotecnología en Madrid, España por el Dr. Fernando Lledías nos han permitido iniciar la caracterización estructural del proteasoma utilizando microscopía electrónica. Los primeros resultados nos indican que es posible diferenciar distintas estructuras proteasomales en las preparaciones realizadas en nuestro laboratorio. Por tanto hemos decidido extender y optimizar este análisis con la idea de identificar estructuras específicas de la respuesta al estrés. Esto último, junto con el análisis bioquímico y de espectrometría de masas nos dará un panorama integral del papel del proteasoma en la defensa de las plantas al estrés.