En nuestro grupo de trabajo nos hemos enfocado al estudio de la diversidad bacteriana presente en el pulque y que ha sido previamente apoyado por un financiamiento PAPIIT (IN224110-2) empleando una aproximación polifásica determinando la presencia de un diversidad bacteriana conformada por diversos microorganismos previamente considerados como esenciales para la fermentación como son L. mesenteroides. Z. mobilis, S. cerevisisae (Sánchez-Marroquín, 1949; 1970; Sánchez-Marroquín and Hope, 1953; Sánchez-Marroquín et al., 1957, García-Garibay y López-Munguía, 1993), pero de forma interesante también, una gran diversidad de bacterias áciddo lácticas (LAB) y Proteobacterias no reportada previamente entre los que destacan las LAB L. citreum, L. kimchii, Lactobacillus acidophilus, en muestras de pulque procedentes de diferente origen geográfico y durante el desarrollo de una fermentación en laboratorio (Escalante et al., 2004; 2008). Estos resultados nos han permitido cuestionar el papel esencial tradicionalmente asociados a la producción de esta bebida. A partir de estos resultados nos hemos dedicado a la caracterización genómica y fisiológica de diversas LAB asiladas en estos trabajos previos y que se describen a continuación: 1. El aislamiento de dos cepas de LAB identificadas como L. kimchii productoras de dos nuevos EPS presentes en el pulque cuya estructura fue analizada por resonancia magnética nuclear y por microcopia electrónica de barrido de emisión de campo (Torres-Rodríguez et al., 2013, sometido (se anexa manuscrito sometido como material adjunto en PDF). 2. El aislamiento y caracterización de una cepa de L mesenteroides P45 con potencial actividad probiótica por su capacidad de inhibir in vitro el crecimiento de microorganismos patógenos y su capacidad de disminuir in vivo la infección de Salmonella enterica serovar Typhimurium en modelos de ratones (tesis de licenciatura de Campos, 2010 y Matus, 2011). 3. La secuenciación del genoma de la cepa de L. mesenteroides P45 y la conclusión de la anotación de su genoma. Con base en estos antecedentes y experiencia generada en nuestro grupo de trabajo, la presente propuesta que se somete tiene como finalidad continuar trabajando sobre la caracterización de la diversidad microbiana, genética y metabólica de las LAB presentes en el pulque, enfocando nuestros esfuerzos en tres líneas principales: 1. El aislamiento y caracterización de cepas identificadas en el pulque como L. acidophilus, la LAB más abundante en esta bebida durante su fermentación, evaluación de su posible potencial probiótico para que junto con los trabajos que continuamos realizando a la fecha, podamos aportar bases científicas a los beneficios de la farmacopea tradicional asociados a esta bebida hacia la salud humana. 2. Estudio de la diversidad de LAB productoras de EPS en muestras de pulque y aguamiel colectadas de diferentes regiones geográficas y la caracterización estructural de estos EPS. 3. Estudio de la diversidad bacteriana de endófitos asociados naturalmente a la planta de maguey en la piña y paredes del cajete (cavidad donde se acumula el aguamiel en magueyes productores) con la finalidad de determinar el impacto de la presencia de esta posible diversidad bacteriana sobre la degradación de los azúcares sacarosa, fructosa, glucosa y fructo-oligosacáridos presentes en la savia de la planta y su importancia sobre en el inicio del proceso de fermentación del aguamiel.

De acuerdo a las tres líneas principales que se abordarán en la presente propuesta y que se describen en la parte final de la sección de antecedentes, este proyecto pretende en primer lugar generar conocimiento sobre la diversidad bacteriana, genética y metabólica del pulque con base en los siguientes enfoques específicos: 1. Aislamiento y caracterización fisiológica enfocado al análisis del potencial probiótico de la LAB Lactobacillus acidophilus. Esta LAB fue detectada en trabajos previos de nuestro grupo de trabajo (Escalante et al., 2004; 2008), como el microorganismo más abundante presente en tres muestras de pulque de distinto origen geográfico (Huitzilac, Morelos; Aculco, Estado de México y Tizayuca, Hidalgo) y así como durante las últimas tres horas de fermentación en un estudio sobre de los cambios de la diversidad bacteriana presente durante una fermentación de pulque, empleando un enfoque de análisis de diversidad dependiente y no dependiente de cultivo y que se basó en el análisis de secuencias de ADNr 16S amplificados a partir del ADN microbiano total del pulque. La información que se obtenga de esta propuesta permitirá incrementar la evidencia científica que se sumará a los resultados que hemos obtenido en nuestro grupo de trabajo con la caracterización de la capacidad antimicrobiana in vitro e in vivo con la cepa de Leuconostoc mesenteroides P45, y que soporta aquellos beneficios hacia la salud humana como resultado del consumo de pulque de forma directa o indirecta que se manejan como parte de la farmacopea tradicional mexicana. 2. El aislamiento y caracterización de LAB productoras de nuevos EPS a partir de muestras de pulque de diferente origen geográfico permitirá conocer la diversidad estructural de estos polímeros que confieren una de las características sensoriales distintivas más importantes del pulque y que es su viscosidad. Es importante destacar que estudios de nuestro grupo de trabajo permitieron aislar dos cepas de L. citreum productoras de EPS permitieron analizar por primera vez a nivel estructural por microscopia electrónica de barrido de emisión de campo la relación estructural del EPS con la superficie célular bajo condiciones de producción del polímero y su caracterización por resonancia magnética nuclear y por hidrólisis enzimática, identificando en la fracción soluble y asociada a la célula de una de éstas cepas un EPS de tipo dextrana ramificado, mientras que para la segunda cepa se detectó en la fracción soluble dextrana de tipo lineal y en la fracción asociada a células, una mezcla de dextranas lineal y levana (Torres-Rodríguez et al., 2013 sometido). Es importante destacar que la muestra de pulque analizada procede de la localidad de Huitzilac, Morelos, zona en la que se ha observado que el pulque producido es menos viscoso en relación a muestras procedentes de Estados con una mayor tradición en producción de pulque, como son Hidalgo o Tlaxcala. 3. El análisis de la diversidad bacteriana endófita a la planta de maguey, particularmente asociada a la piña del maguey, a las paredes de la cavidad (cajete) donde se acumula el aguamiel durante el proceso de raspado realizado durante la vida útil de producción de aguamiel del maguey, permitirá conocer el impacto que tiene la diversidad bacteriana endófita nativa sobre la composición de la diversidad bacteriana presente en el aguamiel y que se caracteriza por una gran abundancia de LAB identificadas como L. citreum y L. kimchii para una muestra de pulque de la región de Huitzilac, Morelos (Escalante et al., 2008). 4. Productos derivados de la investigación. a. En cuanto a la formación de recursos humanos se pretende la graduación de al menos dos alumnos de licenciatura. En este momento dos alumnos de la carrera de Química de Alimentos, Facultad de Química, UNAM, se encuentran realizando una estancia semestral la cual se pretende sea la bases de su tesis de licenciatura y se espera reclutar a dos alumnos de posgrado. b. Los trabajos realizados hasta la fecha en la investigación sobre la diversidad microbiana, metabólica y genética del pulque han permitido la publicación de dos artículos en revistas científicas internacionales, la invitación para la escritura de un capítulo (ya publicado) sobre la fermentación del pulque en un libro técnico internacional con ISBN (CRC Press), un artículo sometido a la revista Food Microbiology y se tiene prácticamente el primer borrador anotado del genoma secuenciado de la cepa de L. mesenteroides P45 con potencial actividad probiótica,lo cual hasta donde es de nuestro conocimiento resultaría en el primer genoma secuenciado de una bebida fermentada tradicional mexicana. Se espera que los resultados de este proyecto permitan la publicación de al menos dos artículos de investigación y uno de revisión en revistas científicas internacionales. c. Se pretende la presentación de los resultados parciales y finales de este proyecto en al menos un congreso nacional y uno internacional. Es importante destacar que como resultado de nuestra experiencia desarrollada en el análisis de la diversidad bacteriano se establecieron colaboraciones con el grupo de investigación del Dr. Rogelio Valadez Blanco, del Instituto de Agroindustrias, Universidad Tecnológica de la Mixteca a quien se ha apoyado con la identificación de la diversidad de bacterias lácticas aisladas de muestras de pulque de la región de los Altos de Oaxaca, cuyos resultados preliminares se presentaron como contribución oral en el pasado XV Congreso Nacional de Biotecnología y Bioingeniería- XII Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms realizado en Cancún, QR, México del 23 al 28 de Junio de 2013 y con el grupo de investigación del Dr. Tetsuya Ogura del Departamento de Química, Universidad Autónoma de Guadalajara con quienes se colaboró para la caracterización de la diversidad de bacterias endófitas de la planta de Agave tequilana y que dio como resultado la elaboración del manuscrito: Martínez-Rodríguez JC, De la Mora-Amutio M, Plascencia-Correa LA, Audelo-Regalado E, Torres-Guardado FR, Hernández-Sánchez E, Peña-Ramírez YJ, Beltrán-García MJ, Escalante A, Ogura T. Cultivable endophytic bacteria in Agave tequilana stem and their role as plant growth promoters. A someterse en breve a la revista Environmental Microbiology Reports.