Las Especies Reactivas de Oxígeno (ERO), como el peróxido de hidrógeno y superóxido son moléculas de oxígeno reducidas y altamente reactivas que participan en diversas funciones, tanto en células animales como vegetales. Las mitocondrias, los cloroplasto y los peroxisomas producen una gran cantidad de ERO como resultado del metabolismo aeróbico. Sin embargo, también se producen de manera controlada en respuesta a patógenos, en la señalización hormonal, en estreses abióticos y bióticos, y durante la estructuración de la pared celular. Las NADPH oxidasas son las enzimas de membrana que están fuertemente involucradas con la producción del radical superóxido y por lo tanto su actividad está fuertemente regulada, tanto a nivel de la proteína como del mismo ambiente membranal en el que se encuentra. De hecho las evidencias sugieren que se localizan en microdominios membranales como los "lipid rafts". El estudio de las ERO en células vegetales está restringida a ensayos bioquímicos y el uso de sondas fluorescentes. El uso de ensayos bioquímicos permite ver la producción de ciertas especies de ERO, pero se limitan a determinar lo que había en esa célula al momento de aplicar el sustrato oxidable. Las sondas fluorescentes sintetizadas químicamente, permiten ver la producción de ROS en células vivas, sin embargo, estas sondas se oxidan de manera irreversible y no es posible ver los aumentos y disminuciones en los niveles de ERO. Por lo tanto estos enfoques únicamente permiten correlacionar los niveles de ERO en un momento particular, cuando se adiciona la sonda. Recientemente se desarrolló la sonda molecular Hyper capaz de detectar peróxido de hidrógeno (H2O2) con alta especificidad. Hyper consiste en una YFP circularmente permutada (cpYFP) a la cual se le ha adicionado la región OxyR de Escherichia coli que le permite unir el H2O2 y aumentar su fluorescencia. Esta construcción se puede expresar genéticamente en células animales o vegetales y es capaz de servir como una sonda molecular para medir de manera cuantitativa y específica el H2O2 intracelular a diferentes tiempos. En este trabajo proponemos utilizar Hyper 1, y otras dos nuevas versiones mejoradas (Hyper 2 y 3) para responder preguntas fundamentales como la contribución del H2O2 intracelular durante el crecimiento polar y durante la formación del hilo de infección, dos procesos que constituyen modelos importantes en el estudio de la polaridad celular. Además de abordar la contribución de los microdominios membranales a la localización de las NADPH oxidasa y su actividad.

Visualización de H2O2 en células vegetales vivas. Los cambios intracelulares de ERO constituyen firmas particulares de señalización que permiten montar una respuesta adecuada ante diversos estímulos tanto bióticos como abióticos. Esto es muy similar al calcio intracelular, es decir que no sólo la distribución espacial pero también la dinámica temporal de las ERO resulta importante para una respuesta dada. Es decir que un cambio en los niveles de ERO a nivel de la pared celular tendrá un efecto distinto a un cambio en el citoplasma o algún organelo particular. Además, la magnitud y la periodicidad de la respuesta, también resultan importante. Sin embargo, la correlación de los microdominios lipídicos y la distribución y actividad de la NADPH oxidasa ha sido pobremente estudiada debido a limitaciones metodológicas. Los ensayos bioquímicos han sido ampliamente utilizados para analizar la producción de ERO. El 3,3´-Diaminobenzidine (DAB), por ejemplo es uno de los sustratos más usados para determinar la producción de H2O2. Este compuesto forma un precipitado obscuro como resultado de la polimerización del DAB (Driever et al., 2009). Por otro lado el Nitro Blue Tetrazolium (NBT), se usa ampliamente para determinar la producción del superóxido, el cual genera un precipitado azul, estos enfoques ha sido de gran ayuda para visualizar la producción de superóxido durante las interacciones planta-patógeno y durante la respuesta a diversos estreses bióticos y abióticos (Swanson et al., 2011). Uno de los mayores problemas de estos enfoques es la incapacidad de poder realizar estudios dinámicos, es decir que únicamente podemos determinar lo que hay en ese momento, pero no qué sucede después. Esto básicamente debido a la naturaleza de la sonda y al efecto tóxico de estos compuestos sobre las células. Por lo tanto los resultados deben de ser interpretados con mucho cuidado y considerar las limitaciones técnicas (Driever et al., 2009). Por otro lado las sondas fluorescentes derivadas de la fluoresceína, particularmente la diacetato de dihydrodichlorofloresceina (H2DCF-DA), representa la sonda fluorescente químicamente sintetizada que más se utiliza para visualizar las ERO en células vivas. H2DCF-DA es un compuesto no fluorescente hasta que entra en contacto con las ERO. La sonda está esterificada para una mayor permeabilidad a la membrana de las células y posteriormente por actividad de las esterasas intracelulares, este grupo éster se rompe y genera una molécula impermeable. Esto permite que la sonda fluorescente se retenga en el citoplasma. La primera desventaja de H2DCF-DA radica en que no es selectiva y por lo tanto no es específica. Sin embargo, la desventaja más grande de la sonda fluorescente es su inestabilidad, esto debido a la susceptibilidad de experimentar foto-oxidación y foto-blanqueado. Finalmente, el problema general con H2DCF-DA es muy similar a DAB y NBT, una vez que el H2DCF-DA reacciona con las ERO, este se oxida irreversiblemente volviéndose fluorescente, por lo tanto la dinámica de las ERO no puede determinarse. Algunas estrategias metodológicas utilizando el mismo método pueden proporcionar la dinámica, pero este depende mucho del tipo celular que se quiere estudiar y del equipo con que se cuente (Monshausen et al., 2007; Cárdenas and Quinto, 2008). Hyper como una nueva sonda molecular y una alternativa para el estudio dinamico de las ERO. Las sondas moleculares que pueden expresarse genéticamente han sido de gran ayuda para impulsar el conocimiento de la biología celular. Existen actualmente sondas que se basan en las GFP o las proteínas bio-luminiscentes que pueden medir calcio, ATP, GMP cíclico, pH, entre otros (Zhao et al.). Hasta hace poco la única sonda molecular que se describió que permitía detectar ROS lo hace de manera no especifica, y con una eficiencia cuántica o de fluorescencia muy baja, de manera únicamente cualitativa y no cuantitativa (Jiang et al., 2006). La sonda molecular Hyper ha venido a revolucionar el campo por diversas razones. Es una proteína YFP, la cual ha sido circularmente permutada (cpYFP) e insertada dentro de la región regulatoria del dominio OxyR de Escherichia coli, este dominio OxyR constituye la región sensible al H2O2. La clave de esta región o dominio consiste en 2 residuos de cisteína (Cys199 and Cys208). Cuando este dominio OxyR se expone a H2O2, este promueve la formación de enlaces disulfuro, induciendo un cambio intramolecular que cambia el pico de excitación de la YFP de 420 a 500 nm, mientras que el pico de emisión permanece igual (516 nm). Este cambio inducido por H2O2 en la longitud de excitación de Hyper permite su uso como un sensor radiométrico (cuantitativo) de manera similar a otras sondas moleculares como el fura-2 para la detección de calcio intracelular. Sin embargo, la gran diferencia es que Hyper es una sonda molecular codificada genéticamente y por lo tanto se puede expresar para visualizar los cambios de H2O2 en células vivas, bajo condiciones experimentales que se acercan mucho más a las condiciones fisiológicas. Hyper es capaz de registrar tanto aumentos como disminución en la concentración de H2O2 intracelular debido a su propiedad oxido-reductiva del dominio sensible a H2O2, es decir la reversibilidad de poder inducir la reducción de los puentes disulfuro por acción del poder reductor endógeno de la célula. Además, debido a que se expresa genéticamente, se le puede adicionar también “secuencias señales” necesarias que le permitan expresarse en ciertos tejidos o bien localizarse en organelos de interés como los peroxisomas, las mitocondria, los cloroplastos, etc. (Costa et al., 2010). Es decir Hyper puede utilizarse como un bio-sensor universal para monitorear en tiempo real los niveles intracelulares de ERO en células vegetales. De esta manera podremos utilizar tres variantes de Hyper que se han generado recientemente, Hyper 2 y 3, todas ellas con pequeñas diferencias que les dan otras cualidades como un mejor rango dinámico y una mayor sensibilidad. Además, podremos adicionarles secuencias señales para su exportación a la pared celular o al núcleo de la célula para determinar la contribución subcelular del H2O2 durante el proceso de infección. El núcleo por ejemplo, experimenta oscilaciones de calcio muy importantes durante la infección y su posible relación con ERO resulta por demás interesante. Para esto combinaremos el potencial radiométrico de la sonda molecular, conjuntamente con la microscopia de dos fotones para visualizar los cambios durante la formación del hilo de infección y la organogénesis del nódulo. Esto nos permitirá estudiar los microdominios lipídicos, y la distribución subcelular de ERO en células vivas y en tiempo real durante la formación del hilo de infección. Al mismo tiempo generaremos una herramienta molecular muy importante para el estudio de las ERO en células vegetales en respuesta a todo tipo de estreses bióticos y abióticos.