Mucha especies de angiospermas son muy selectivas al elegir con quién tener descendencia. Esto les permite evitar la autofecundación y sus consecuencias negativas en la diversidad genética y en la adaptación. Entre las estrategias que les permite promover la polinización curazada con éxito, se encuentra el desarrollo de estructuras florales atractivas para los polinizadores, así como mecanismos genéticos que les permiten reconocer y eliminar el polen polen genéticamente muy relacionado. El sistema de reconocimiento del polen se conoce como sistema de incompatibilidad (SI), y en varias especies está controlado por el locus multialélico S, el cual determina la especificidad del reconocimiento tanto en la parte masculina (grano de polen) como en la femenina (pistilo).
En la familia Solanaceae, el SI es gametofítico. La determinante femenina codifica una ribonucleasa especifica del pistilo, denominada S-RNasa; mientras que la determinante masculina codifica una proteína con una caja F específica del polen, llamada SLF. Para que ocurra el rechazo del polen, las determinantes de la especificidad del mismo haplotipo interaccionan físicamente en el citoplasma del tubo polínico (TP).
Además de las determinantes de especificidad, se requiere de los productos de otros genes tanto estilares como del polen que no están ligados al locus S. Al momento, sólo se han identificado dos genes estilares que están directamente involucrados en el rechazo del polen: HT-B y 120K.
Como puede apreciarse, el pistilo juega un papel preponderante en el reconocimiento del polen, ya que este órgano femenino al parecer evolucionó para producir moléculas que brinden, por un lado, sustento alimenticio o a los tubos polínicos (TP) deseados para fecundar a los óvulos y, por otra parte, aquellos factores que le permitan seleccionar y eliminar a los TP que le presenten un inconveniente genético, por provenir de pólenes producidos por la misma planta , de sus padres o/y de sus hermanos.
En nuestro grupo nos hemos dado a la tarea de indentificar factores estilares no ligados al locus S que participen en el rechazo del polen en Nicotiana. Utilizando estrategias de genética molecular, identificamos a dos genes estilares: NaTrxh y NaStEP. El gen NaTrxh se expresa preferentemente en especies incompatibles de Nicotiana y codifica una tiorredoxina h que se secreta a la matriz extracelular del tejido de transmisión de los estilos de N. alata. Además, NaTrxh reduce a las S-RNasas in vitro (Juárez-Díaz et al., 2006. JBC). El gen NaStEP codifica una glicoproteína con homología a inhibidores de proteasas tipo Kunitz. Tanto el transcrito como la proteína de NaStEP tienen una expresión y una localización específica en el estigma. NaStEP se almacena en las vacuolas de las células papilares del estigma, pero cuando los estigmas son polinizados se libera al exudado estigmático, en donde interacciona con el polen y los tubos polínicos (Busot-González et al., 2008. JXB). De esta manera, debido a las características de estos genes, consideramos que éstos tienen un potencial alto de ser parte de la vía bioquímica del rechazo del polen en Nicotiana. Es por esto que el objetivo general del proyecto es evaluar la función en el rechazo del polen de NaTrxh y NaStEP, así como establecer la ruta de secreción que sigue la tiorredoxina NaTrxh en Nicotiana. Para resolver este objetivo, esencialmente se generarán plantas transgénicas de Nicotiana donde la expresión de ambos genes se encuentre silenciada, determinando así su efecto en el reconocimiento y rechazo del polen. Además, en el caso de NaStEP buscaremos si esta proteína interacciona con proteínas del tubo polínico, utilizando básicamente a NaStEP como anzuelo en ensayos de doble híbrido en levaduras y ensayos bioquímicos de interacción proteína-proteína.
Por otra parte, debido a que la secreción de NaTrxh es un evento novedoso en sistemas vegetales, por carecer de un péptido señal ortodoxo, determinaremos qué región de la NaTrxh es la responsable de su secreción al apoplasto, construyendo por mutagénesis dirigida diferentes versiones de la proteína y evaluando su ruta de secreción en plantas transgénicas de N. tabacum y en ensayos de expresión transitoria en hojas de N. benthamiana. Finalmente, se rastreará in vivo por microscopía electrónica de transmisión la ruta que sigue NaTrxh para su secreción al apoplasto.
Los resultados de esta investigación tendrán un impacto sumamente relevante tanto en el área de incompatibilidad sexual, ya que de participar NaTrxh y NaStEP, se podrán ir disecando las vías bioquímicas que conducen al del rechazo del polen en sistemas basados en S-RNasas. Además, se hará una fuerte contribución en el área del tráfico de proteínas en plantas, ya que NaTrxh parece seguir para su secreción al apoplasto una vía independiente al retículo endoplásmico y el aparato de Golgi, las cuales no están descritas en plantas.

En nuestro grupo trabajado con los sistemas de incompatibilidad basados en S-RNasa usando como modelo a Nicotiana alata. Los datos obtenidos con recursos propios tanto materiales como humanos resultaron ser una parte fundamental de la publicación de Goldraij et al. (Nature, 2006) en colaboración con el grupo del Dr. McClure, trabajo en donde esencialmente se explican las relaciones de compatibilidad/incompatibilidad mediante el secuestro de las S-RNasas en la vacuola y su tráfico al citoplasma del TP, antes que por la degradación de las S-RNasas vía el proteosoma 26S, como lo proponen Qiao et al. (2004) y Zhihua y Kao (2006). Los hechos que sustentan el modelo descrito antes son sólidos; sin embargo, a pesar de que el modelo de Goldraij et al. (2006) incluye a algunos factores estilares (HT-B y 120K), hay evidencia genética que indica que otros factores estilares no ligados al locus S son esenciales para la respuesta de incompatibilidad.
En este tenor, el trabajo delineado en este proyecto se pretende seguir contribuyendo a explicar de una forma integral la vía bioquímica del rechazo del polen en los sistemas basados en S-RNasa, como el de Nicotiana, y continuar con la identificación de genes modificadores del estilo, así como con experimentos bioquímicos que permitan ir estableciendo la mecanística que opera en la incompatibilidad. La determinación de las moléculas que participan en el fenómeno de incompatibilidad es una condición indispensable para conocer los detalles mecanísticos del proceso.
En particular, en nuestro grupo indentificamos dos genes estilares: NaTrxh y NaStEP. El gen NaTrxh se expresa preferentemente en especies incompatibles de Nicotiana y codifica una tiorredoxina h que se secreta a la matriz extracelular del tejido de transmisión de los estilos de N. alata. Además, NaTrxh reduce a las S-RNasas in vitro (Juárez-Díaz et al., 2006. JBC). El gen NaStEP codifica una glicoproteína con homología a inhibidores de proteasas tipo Kunitz. Tanto el transcrito como la proteína de NaStEP tienen una expresión y una localización específica en el estigma. NaStEP se almacena en las vacuolas de las células papilares del estigma, pero cuando los estigmas son polinizados se libera al exudado estigmático, en donde interacciona con el polen y los tubos polínicos (Busot-González et al., 2008. JXB).
De esta manera, consideramos que los resultados de esta investigación tendrán un impacto sumamente relevante tanto en el área de incompatibilidad sexual, ya que de participar NaTrxh y NaStEP, se podrán ir disecando las vías bioquímicas que conducen al del rechazo del polen en sistemas basados en S-RNasas. Además, se hará una fuerte contribución en el área del tráfico de proteínas en plantas, ya que NaTrxh parece seguir para su secreción al apoplasto una vía independiente al retículo endoplásmico y el aparato de Golgi, las cuales no están descritas en plantas.