Varias evidencias experimentales obtenidas recientemente cuestionan este modelo clásico de fecundación en mamíferos. Para empezar, los canales de Ca2+ dependientes de voltaje (CaVs) propuestos como los responsables de la primera entrada transitoria de Ca2+ cuando el esperma encuentra al óvulo, se expresan al mínimo o están ausentes en el gameto maduro. Estos resultados dejan abierta la pregunta sobre la identidad de los canales de Ca2+ responsables de la reacción acrosomal (RA), el evento de exocitosis que libera a las enzimas hidrolíticas del acrosoma para que el espermatozoide penetre la capa externa del óvulo. Hasta la fecha solo se ha encontrado un tipo de canales de Ca2+ en el espermatozoide maduro, el canal de Ca2+ CatSper. Sin embargo el knock out de CatSper afecta la motilidad espermática pero no a la RA. Por otra parte, varias evidencias experimentales indican que no hay un solo inductor fisiológico de la RA y que este evento de exocitosis ocurre mucho antes de que el espermatozoide encuentre al óvulo. Estas nuevas observaciones implican que, como consecuencia de la RA, el espermatozoide reaccionado expone a la membrana acrosomal interna producto de la fusión de la membrana acrosomal con la membrana celular. Como consecuencia de este proceso de exocitosis es altamente probable que la membrana acrosomal interna exprese una nueva composición de canales iónicos, además de distintos receptores, los cuales podrían ser determinantes para la fecundación. Hasta la fecha nadie ha explorado si alguno de los canales iónicos expuestos del acrosoma pudiera tener un papel relevante en la motilidad, la fusión de los gametos o en la activación del óvulo por el espermatozoide reaccionado.
En este sentido, la presente propuesta constituye un proyecto exploratorio novedoso que pretende abordar la caracterización de los canales iónicos presentes en el espermatozoide reaccionado para evaluar su posible participación en la fecundación en mamíferos desde una perspectiva que cuestiona al modelo clásico de fecundación descrito anteriormente. Este nuevo paradigma se fundamenta en las observaciones recientes mencionadas en el párrafo anterior. Para realizar esta caracterización de canales iónicos en un modelo experimental nunca antes utilizado, proponemos establecer y estandarizar una técnica electrofisiológica de vanguardia que no se ha utilizado en nuestro país: la técnica de fijación de voltaje exploratoria (o Smart-Patch) la cual facilita el registro de canales iónicos de células pequeñas o de estructuras submicrométricas de la célula que son inaccesibles por métodos convencionales. Esta poderosa técnica electrofisiológica combina la microscopia de conductancia iónica exploratoria con el registro electrofisiológico por fijación de voltaje a través de nanopipetas de vidrio. Con esta técnica pretendemos explorar la presencia de canales iónicos en la membrana acrosomal interna y caracterizar sus propiedades biofísicas. Por otra parte, el uso de la microscopia de conductancia iónica exploratoria nos permitirá monitorear a la RA con una resolución cercana a la microscopia de fuerza atómica sin tener la desventaja del contacto directo con la superficie membranal, lo que nos permitirá obtener el perfil topográfico de la membrana celular que reflejará las alteraciones que ocurran en la membrana durante la RA. Esto nos permitirá confirmar claramente que célula está verdaderamente reaccionada para realizar la caracterización de los canales iónicos presentes en ella.

Varias evidencias experimentales obtenidas recientemente cuestionan al modelo clásico de fecundación en mamíferos. En este sentido, la presente propuesta constituye un proyecto exploratorio novedoso que pretende abordar la caracterización de los canales iónicos presentes en el espermatozoide reaccionado para evaluar su posible participación en la fecundación en mamíferos desde una perspectiva que cuestiona al modelo clásico de fecundación descrito anteriormente. Este nuevo paradigma se fundamenta en las observaciones recientes mencionadas en el resumen y los antecedentes de este proyecto. Para realizar esta caracterización de canales iónicos en un modelo experimental nunca antes utilizado proponemos establecer y estandarizar una técnica electrofisiológica de vanguardia que no se ha utilizado en nuestro país: la técnica de fijación de voltaje exploratoria (o Smart-Patch), la cual facilita el registro de canales iónicos de células pequeñas o de estructuras submicromolares de la célula que son inaccesibles por métodos convencionales. Esta poderosa técnica electrofisiológica combina la microscopia de conductancia iónica exploratoria con el registro electrofisiológico por fijación de voltaje a través de nanopipetas de vidrio. Con esta técnica pretendemos explorar la presencia de canales iónicos en la membrana acrosomal interna y caracterizar sus propiedades biofísicas. Es importante resaltar que el uso de esta metodología nos permitirá incrementar la probabilidad de lograr un registro electrofisiológico, ya sea en la modalidad de célula completa o de canales unitarios. Probabilidad que es baja usando los métodos electrofisiológicos convencionales.
Por otra parte, el uso de la microscopia de conductancia iónica exploratoria nos permitirá monitorear a la RA con una resolución cercana a la microscopia de fuerza atómica sin tener la desventaja del contacto directo con la superficie membranal, lo que nos permitirá obtener el perfil topográfico de la membrana celular que reflejará las alteraciones que ocurran en la membrana durante la RA. Esto nos permitirá confirmar claramente que célula está verdaderamente reaccionada para realizar la caracterización de los canales iónicos presentes. En el presente proyecto se anexan dos figuras correspondientes a resultados preliminares obtenidos sobre los perfiles topográficos de los espermatozoides de humano y de jabalí, adquiridos con microscopia de conductancia iónica exploratoria adquiridos con nuestro sistema (ver descripción de las mismas en la sección de estrategia experimental y metodología).
Hasta la fecha la estrategia más utilizada para el registro de los canales iónicos presentes en el espermatozoide consiste en realizar un sello de alta resistencia en la gota citoplasmática del espermatozoide maduro, la cual es una subestructura celular originada por la eliminación del citoplasma del gameto durante su morfogénesis y la compactación de su núcleo. Con esta estrategia experimental se han logrado avances importantes en la identificación y caracterización de canales iónicos presentes principalmente en el flagelo del espermatozoide, tales como el canal CatSper ((Kirichok, Navarro, & Clapham, 2006)) o canales P2X2 activados por ATP (Navarro, Miki, & Clapham, 2011). Sin embargo ha mostrado algunas limitaciones para el registro de otros canales iónicos presentes en la cabeza de este gameto, como lo demuestran los trabajos sobre los canales iónicos pobremente caracterizados presentes en las regiones ecuatorial y acrosomal de espermatozoides no reaccionados (Jime, 2007). En estos trabajos se reportaron tres tipos de actividad de canales: el primero de estos corresponde a un canal permeable a aniones de aperturas estables y de larga duración; el segundo canal presenta una alta oscilación entre los estados abierto y cerrado que depende de factores citoplasmáticos. Ambos canales están presentes en el segmento ecuatorial del esperma. El tercer tipo de canal iónico también presenta una alta variabilidad entre los estados abierto y cerrado pero presenta una probabilidad de apertura más dependiente de voltaje y tiene una distribución más amplia en el espermatozoide no reaccionado, aunque no se encuentra en la región anterior al acrosoma (Jime, 2007). Por último, utilizando la configuración de parche perforado en la cabeza del espermatozoide no reaccionado se caracterizó un canal aniónico activado por Ca2+ cuya farmacología sugiere que pertenece a la familia de canales de anoctamina o TMEM16A ((Orta et al., 2012)). Estos trabajos sugieren que aun cuando el registro electrofisiológico en la gota citoplasmática del espermatozoide no reaccionado ha permitido caracterizar a los canales iónicos presentes en el flagelo de este gameto, no es suficiente para registrar a los canales iónicos presentes en la cabeza del mismo. Con base en estas observaciones, el presente proyecto propone utilizar la técnica de fijación de voltaje exploratoria, o Smart Patch, para dirigir la búsqueda de los canales iónicos del espermatozoide reaccionado a la cabeza de este gameto.
Las nuevas observaciones implican que, como consecuencia de la RA, el espermatozoide reaccionado expone a la membrana acrosomal interna. Como consecuencia de este proceso de exocitosis es altamente probable que la membrana acrosomal interna exprese una nueva composición de canales iónicos los cuales podrían ser determinantes para la fecundación. Hasta la fecha nadie ha explorado si alguno de los canales iónicos del acrosoma incorporados a la membrana celular pudiera tener un papel relevante en la motilidad, la fusión de los gametos o en la activación del óvulo por el espermatozoide reaccionado. El identificar y caracterizar a nuevos canales iónicos implicara una revaloración de los conceptos que hasta ahora se tienen de la fecundación en mamíferos.