Nuestro grupo ha demostrado que la activación del eje hipotálamo-hipófisis-tiroides (HPT) y en particular, de el incremento rápido (<1h) de la síntesis y liberación de TRH en respuesta a exposición de ratas al frío, o un aumento en la actividad física, está atenuada por el grado de estrés percibido por el animal, proporcionalmente a los incrementos en corticosterona en sangre. La comparación entre los distintos paradigmas conductuales nos permitió evidenciar que las variaciones en las concentraciones del RNAm de TRH, en la liberación de TRH ó TSH, correlacionan positivamente con la locomoción (distancia recorrida o velocidad) pero negativamente, con los niveles de corticosterona, y que una fuerte respuesta del eje HPA (causada por las condiciones en que se realizó la prueba o, por estrés precedente) puede atenuar o, inclusive, impedir la activación del eje HPT [51]. In vitro, demostramos que la norepinefrina (NE) vía activación de la adenilato ciclasa/PKA estimula la expresión de TRH a 1h y este efecto está reprimido en la presencia de corticosterona o dexametasona (dex) [94]. Hemos caracterizado los elementos de respuesta del promotor del gen de TRH e identificado el mecanismo involucrado; el GR activado interactúa con la PKAc evitando la fosforilación de CREB y su unión al promotor del gen de TRH [34]. Inhibidores de la ERK anulan el efecto represor de dex sugieriendo la importancia de la translocación de GR a núcleo [33]. La interferencia de dex a la estimulación causada por incubación de células hipotalámicas con NE ocurre si NE y dex se administran simultáneamente o NE diez minutos antes de dex, pero no al revés [65]. En cambio, in vivo el efecto estimulador de la exposición al frío (1h), sobre el HPT, se inhibe si los animales son estresados 2h antes [114]; o, el efecto estimulador de 30 min de inmovilización sobre la actividad del HPA se anula si se inyecta corticosterona 1h antes pero no, 3h antes [88]. Estas diferencias pudieran explicarse por los tiempos que requieren la activación de la señalización de glucocorticoides o la de la la adenil ciclasa y su translocación a núcleo, los cuales pueden variar dependiendo del tipo celular y las condiciones de ensayo (in vivo vs. in vitro). El conjunto de estos resultados apoya la propuesta de que la activación de la neurona TRHérgica dependerá del tipo de estímulos que reciba, la situación hormonal o energética en la que se encuentre el animal e, importantemente, la temporalidad en la que coinciden los efectores que incidan sobre ella [51,64]. El presente proyecto propone caracterizar in vivo la cinética de la respuesta de la neurona TRHérgica hipofisiotrópica en animales expuestos al frío, o al ejercicio, y evaluar si es la corticosterona la responsable de la inhibición causada por estrés. Ratas Wistar macho serán expuestas por 15-180 min a frío (4ºC) o a ejercicio y se determinarán los niveles de RNAhn y de RNAm del proTRH en el núcleo paraventricular, así como los niveles séricos de TSH y hormonas tiroideas; se evaluará si la administración de corticosterona, su antagonista (RU480) o metyrapone (inhibidor de la síntesis de corticosterona) modifica la cinética de la activación del eje hipotálamo-pituitaria-tiroides (HPT). Se determinará como un control de la magnitud de la respuesta al estrés, la expresión de CRH y los niveles de corticosterona.

Continua de antecedentes.... Resultados recientes (I.Sotelo) muestran que la interferencia entre GR activado y la señalización por CREB no involucra remodelamiento de la cromatina (no se reclutan deacetilasas de histonas como con T3 [41,61]; niveles de H-acetilasas o de RNA-pol II son reclutadas al nivel de control; GR y PKAc (no pCREB) son coinmunoprecipitados; por inmunocitoquímica- disminución de pCREB y de GR en el núcleo de células estimuladas con forskolina y dex comparado a las estimuladas con las drogas por separado. Estos resultados sugieren una interacción GR:PKAc evita la fosforilación de CREB en el núcleo y la translocación de GR (similar a lo reportado para CRH) [88,116]. La interacción GR-PKAc puede estar influenciada por la dinámica espacio-temporal de los cambios producidos por activación del GR, que depende del tráfico celular (5 min al núcleo), de la concentración de ligando, las actividades de cinasas y la interacción con otras moléculas [17,24,70,117] y, del efecto de neurotransmisores (i.e. NE) sobre la adenilato ciclasa transmembranal, los niveles de AMPc y activación de PKA (segundos; PKA fosforila proteínas intracelulares en 2.5 min); la etapa más lenta es el tráfico de la PKA catalítica al núcleo (17 min) [13,49]. Influyen también las concentraciones de AMPc disminuyen por acción de las fosfodiesterasas cuya actividad es también modulable. CONTRIBUCIÓN DEL PROYECTO: Como se mencionó parcialmente en antecedentes, hemos demostrado que la activación del eje HPT y en particular, de la síntesis y liberación de TRH es rápida y transitoria por la exposición al frío o por un aumento en la actividad física. En cambio, estrés psicológico causado por 30 min de restricción de movimiento inhibe los parámetros que indican la actividad del HPT. El estrés afecta la respuesta a del eje a situaciones en las que es estimulado; por ejemplo, animales sometidos a un estresor 2h antes de estar expuestos al frío, no presentan la activación esperada. La inhibición por estrés no depende de altas concentraciones existentes de corticosterona provocadas por situaciones crónicas como la restricción de alimento [62] sugiriendo que el efecto inhibitorio depende de la activación del receptor de glucocorticoides GR cercano al efecto estimulador [88]. Diversos autores han estudiado el efecto del estrés psicológico agudo sobre los niveles de TSH y HT encontrando resultados contradictorios que interpretan como debidos a diferencias en la intensidad y controlabilidad del estresor [6,7,43, 55,105] (si el animal puede escapar o no del choque eléctrico, por ejemplo [55]. Nuestros resultados, usando diversos paradigmas experimentales, permitieron distinguir el efecto inhibitorio del estrés, del estimulatorio provocado por la demanda energética de la prueba. En respuesta a un incremento en locomoción, los niveles de RNAm de TRH incrementan rápidamente (20min) así como los de TSH en suero sólo cuando la prueba se realiza durante la fase activa del animal (oscuridad) y no, en la inactiva (luz) cuando hay un incremento muy alto en corticosterona desde los 15 min; la variación individual de los niveles en la expresión de TRH, TSH correlacionó positivamente con locomoción y negativamente con corticosterona. Postulamos que la dicotomía reportada radica tanto en la demanda de actividad física de cada prueba, ya que el ejercicio agudo incrementa la liberación de TSH y hormonas tiroideas [19,47,103], como en la intensidad del estrés percibido. Los resultados obtenidos en el sistema de cultivo primario de células hipotalámicas permitieron reproducir la respuesta rápida en el incremento de los niveles de RNAm de TRH al estimular las células con NE o con drogas como forskolina o análogos de AMPc que causan la activación de la PKA. Demostramos que los glucocorticoides interfieren con esta respuesta y el mecanismo involucra la unión proteína:proteína entre GR y la subunidad catalítica de PKA impidiendo la fosforilación de CREB, su unión al elemento de respuesta en el promotor de TRH, y el incremento en la transcripción. La fosforilación de CREB requiere entonces del transporte de la PKAc al núcleo; la capacidad de GR de interactuar con ella y evitar que actúe sobre CREB requiere de coincidencias espacio-temporales. Si bien la información obtenida de sistemas in vitro sugiere esta interacción como uno de los mecanismos posibles, la situación in vivo es seguramente mucho mas complicada. Los tiempos de activación difieren dependiendo del tipo celular, el efector que activa la adenilato ciclasa transmembranal (o la soluble que presenta activaciones más rápidas de una PKA nuclear [107]), las concentraciones de PKA, de fosfodiesterasas, etc. Puede así vislumbrarse que, el estado en que se encuentra la neurona TRHérgica, la intensidad del estímulo y la concentración de hormonas circulantes antes, durante y después del estímulo, serán determinantes en la respuesta. Queremos ahora caracterizar la dinámica a la cual responde la neurona TRHérgica hipofisiotrópica, responsable de fijar el “set point” del eje hipotálamo-pituitaria-tiroides, y demostrar si es la corticosterona la responsable del efecto inhibitorio del estrés sobre la respuesta de las neuronas TRHérgicas a estímulos como la exposición al frío o el incremento de actividad física y, la reversibilidad del efecto (i.e., cuánto tiempo puede estar inhibida la respuesta de la neurona TRH-ergica ante estímulos constantes como la exposición al frío o cantidad de ejercicio). La relevancia de este proyecto y su contribución radica en que el estrés representa un reto constante de la sociedad moderna a la vida del individuo y contribuye al desarrollo de múltiples padecimientos [29]. Si se pierde la capacidad de mantener el equilibrio homeostático y el buen funcionamiento del eje tiroideo, que es fundamental en el balance energético, causando que la respuesta inmediata ante retos agudos como el aumento en la actividad física o la exposición al frío estén atenuadas por el estrés, las pequeñas deficiencias pueden irse acumulando y ser la causa subyacente de enfermedades donde se sospecha disfunción del eje; por ejemplo, en la fatiga crónica ó la depresión [44,69], ganancia de peso corporal y eventual desarrollo del síndrome metabólico y de la obesidad [18,92,97]. Se menciona la depresión ya que si bien no es directamente un problema metabólico, las HT contribuyen al funcionamiento adecuado del SNC en el adulto, y condiciones como hipotiroidismo están ligadas a la depresión; la administración de HT junto con antidepresivos facilita la recuperación de los enfermos [21,79,104]. Estudios clínicos son realizados en condiciones basales, cambios en niveles de HT o de TSH se observan en cond. de claro hipotiroidismo o hipertiroidismo y sólo por otras manifestaciones se sospecha de hipotiroidismo subclínico [18,44,92]. El alto incremento de corticosterona provocado por prueba de esfuerzo, en individuos cuyo eje HPA está “desregulado”, pudiera afectar respuesta HPT a retos metabólicos agudos y permitir un mejor entendimiento de las situaciones de “eu/sub-tiroidismo subclínico” y las enfermedades relacionadas.