Los organismos pertenencientes al dominio Arquea representan una gran diversidad de hábitats, estilos de vida y divisiones celulares. Estos organismos se caracterizan por presentar una maquinaria basal de transcripción similar, funcional y estructuralmente, a la de los eucariotes. Sin embargo, los reguladores transcripcionales son típicamente bacterianos. Este tipo de organización hace que el estudio exhaustivo de aquellas proteínas a regular la expresión genética y que se unen al DNA sea de gran relevancia, tanto a nivel de secuencia como a nivel de interacción con sus posibles genes blanco. En este trabajo y basados en análisis publicados anteriormente y como continuación del proyecto IN217508, se propone, la reconstrucción y la caracterización de la red regulatoria en las arqueas del género Sulfolobus y en particular en S. solfataricus P2. En el grupo contamos con un análisis del repertorio de FTs para 52 organismos del dominio Arquea, así como para las bacterias modelo Escherichia coli K12, Bacillus subtilis 168. E. coli y B. subtilis serán utilizados como control de los análisis y para tener un enfoque global de la regulación de la expresión genética en las arqueas disponibles. En breve, el repertorio de FTs se evaluará utilizando las anotaciones de bases de datos especializadas, Transcription Factor DB, RegulonDB y DBTBSub, entre otras. Adicionalmente, se compararán las secuencias de los 52 genomas de arqueas previamente identificados con BLAST y se construirán matrices de peso asociadas a dichos reguladores. Se utilizarán las predicciones del hélice-vuelta-hélice y anotaciones de los COGs para tener un repertorio lo más robusto posible. Por otra parte, se utilizarán, las predicciones de las unidades transcripcionales y se seleccionarán aquellas regiones upstream asociadas con el objetivo de identificar posibles sitios de unión al DNA. La predicción de sitios de unión al DNA se realizará utilizando matrices de peso, expresiones regulares e identificación de sitios de novo. Alternativamente, se trabajará en una recopilación de datos de expresión global, en la cual la Dra. Peeters de la Univ. Libre de Bruselas nos proporcionará datos asociados a microarreglos y secuenciación masiva del inicio de la transcripción. La identificación de ortologos se realizará utilizando el concepto del bidireccional best hit, utilizando los reguladores identificados en S. solfataricus. La utilización de Nebulon (predicción de interacciones funcionales entre proteínas), datos de expresión global, text-mining, y datos de expresión masiva, entre otros se utilizará adicionalmente para la reconstrucción de las redes regulatorias. Finalmente, se propone la caracterización experimental de una familia de reguladores (Lrp) que incluyen a probables reguladores globales. En una primera etapa se propone la reconstrucción de la red en los S. solfataricus, para posteriomente expandirlo hacia el resto de los organismos del género Sulfolobus. Adicionalmente, se propone que durante el proceso de reconstrucción, se identifiquen computacionalmente nuevos reguladores transcripcionales y que en su totalidad sean evaluados en términos de su abundancia para identificar eventos de expansión, contracción e invención de novo. El proyecto tiene como una de sus metas principales, más allá de la reconstrucción de la red regulatoria en estos organismos, la identificación de sus módulos funcionales y del papel funcional de los FTs. La caracterización experimental de la proteína consenso y diversas predicciones serán evaluadas en colaboración con la Dra. Peeters.

El presente proyecto es innovador dado que se utilizarán métodos bioinformáticos y experimentales para la reconstrucción de las redes regulatorias en los genomas de diferentes Arqueas y en particular en el de S. solfataricus P2. El proyecto se realizará como una continuación del proyecto financiado anteriormente por PAPIIT (IN209511) y que pretendía analizar de forma exhaustiva el repertorio de FTs para dilucidar su función probable.
En este sentido, la propuesta de este proyecto intenta reconstruir de una forma exhaustiva y con datos altamente confiables, la red regulatoria de diversos genomas de Arqueas y en partícular nos enfocaremos en los organismos pertenecientes al género Sulfolobus. El proyecto, nos permitirá inferir el papel de cada uno de los reguladores transcripcionales en el contexto de una red regulatoria, es decir, con este enfoque podemos identificar aquellos reguladores que pueden ser considerados como globales y aquellos reguladores locales. Adicionalmente, identificaremos promotores, sitios de unión al DNA (sitios operadores y activadores), así como el posible papel de cada regulador desde una perspectiva funcional, es decir, cual es la función más probable en la cual esta involucrado dicho TF. Con dichas predicciones se pretende proveer de la información necesaria con la cual se puedan diseñar e implementar experimentos específicos para corroborar dicha predicción y finalmente, determinar el papel del TF en un contexto global, es decir, el papel dentro de un módulo funcional en la estructura de una red regulatoria.
La reconstrucción de las redes de regulación nos permitirá generar los módulos funcionales. Para dicho fin utilizaremos los datos de regulación existentes en S. solfataricus, y que se compararan con las redes de regulación descritas en las bacterias E. coli y B. subtilis. Dicha comparación nos permitira sugerir diversas hipótesis acerca de la topología de la red. Adicionalmente, utilizaremos análisis de clustering para identificar dichos grupos.
Adicionalmente, nuestro estudio no sólo permitirá generar una colección de datos organizados provenientes de la literatura referentes a la función de los factores de transcripción desde una perspectiva funcional, sino que también nos permitirá generar la infraestructura necesaria para proponer una base de datos que integre la información concerniente a los módulos funcionales en diversos organismos, es decir un depósito de las funciones fisiológicas de los TFs. Asi mismo, el proyecto nos permitirá identificar aquellos reguladores que podrían ser considerados como globales y como locales, y preguntar si este tipo de proteínas están asociadas a familias grandes o pequeñas o bien si son organismo específico o universales, entre otras. Cabe mencionar que el análisis exhaustivo en un S. solfataricus como modelo biológico y considerando los organismos asociados al género Sulfolobus, nos permitirá ser un punto de referencia mundial en la comunidad de los grupos de investigación asociados a entender a las Arqueas como dominio celular.
Se propone la evaluación experimental de una red de regulación utilizando un enfoque novedoso y que consiste en la caracterización de un regulador ancestral, es decir, tomando aquellos reguladores de la familia Lrp (que incluyen los reguladores globales mejor descritos en arqueas, son proteínas pequeñas y asociados a la regulación de genes biosintéticos) se construyó una proteína consenso que se está caracterizando en una cepa de Escherichia coli K12, para posteriormente realizar un análisis proteómico e identificar aquellas proteínas que se están sobreexpresando y que podrían estar reguladas por el nuevo regulador transcripcional, evidenciando su probable papel de regulador global.
Finalmente, el proyecto nos permitirá establecer y mantener la colaboración con los Dres. Peeters (ULB), Dra. Rodriguez (IIMAS, UNAM), Dr. Ibarra (IPN). Adicionalmente, podremos formar gente que participe en el proyecto con enfasis en redes regulatorias y bioinformática.

CONSISTENCIA
El proyecto propuesto por nuestro laboratorio es con miras a continuar consolidando la línea de investigación de la regulación de la expresión genética utilizando enfoques genómicos y bioinformáticos y ofrece la oportunidad de explotar este nicho de investigación tanto en el Instituto como en la UNAM. En esta dirección, el proyecto nos permitirá seguir explorando desde una perspectiva más íntegral la regulación de la expresión genética en las Arqueas (donde somos pioneros en su investigación, tanto a nivel nacional como internacional), en la cual hemos generado diversos artículos tanto científicos como de divulgación asociados al tema. Dichas publicaciones han sido producto de financiamientos anteriores de PAPIIT (IN209511) y que ha permitido generar diversos resultados que ahora estamos integrando utilizando nuevos enfoques computacionales. Por otra parte, el Instituto cuenta con diversos grupos de trabajo que hacen investigación en distintos microorganismos en el área de biología molecular, tratando de dilucidar los mecanismos de regulación que dan cuenta de la expresión de los genes y que adaptan a los organismos a un medio cambiante. Nuestro grupo de trabajo contribuye con un enfoque teórico en el área de bioinformática que será útil para todos aquellos grupos que trabajan en regulación transcripcional en el Instituto y en la UNAM y sobretodo nos pone a la vanguardia de los grupos de investigación en el área de los organismos arqueales, dado que somos pocos los grupos a nivel mundial. Así mismo, nuestro grupo ha contribuido significativamente en la construcción y evaluación experimental de las proteínas consenso (cistatínas) y mostrado la eficiencia funcional en la construcción de dichas proteínas. Finalmente, el grupo ha contribuido en la formación de recursos humanos tanto en el área de docencia como en la formación de licenciados, maestros y doctores no sólo en los programas de nuestra dependencia, sino también en otras escuelas y facultades dentro y fuera de la UNAM.

Como metas mínimas nos proponemos graduar a dos estudiantes de licenciatura y de posgrado, realizar programas públicos para la asignación de función en los TFs y publicar artículos de investigación internacional, durante la realización del proyecto.