Los complejos respiratorios de la mitocondria tienen subunidades codificadas en el DNA mitocondrial (mtDNA) que son altamente hidrofóbicas y que forman el núcleo catalítico del complejo respiratorio. Tal es el caso de citocromo b (Cob), subunidad central del complejo bc1 y Cox1, subunidad central de la citocromo c oxidasa (CcO). La expresión de estas dos proteínas está altamente regulada y se acopla al ensamblaje de los complejos respiratorios. En la presente propuesta nos interesa estudiar cómo se lleva a cabo dicha expresión, enfocándonos en el nivel traduccional. Se sabe que la síntesis de proteínas mitocondriales es un punto de control muy importante. Cada complejo posee chaperonas y factores específicos para su biogénesis, y por lo tanto los mecanismos de acción de dichos factores pueden ser diferentes. 1) Síntesis de Cob: Estudiaremos cómo se regula la síntesis/degradación de Cob dependiente de las subunidades Qcr7 y Qcr8 , con las cuales forma el primer intermediario de ensamblaje. Nuestros datos preliminares indican que en una mutante nula de Qcr7 no hay síntesis aparente de Cob. Estudiaremos a qué se debe esta observación y si el extremo carboxilo terminal de Cob pudiera estar involucrado en dicha observación, ya que el cristal del complejo bc1 muestra que esta región está muy cercana a Qcr7. Este no sería el primer caso en que la misma proteína monitorea y regula su propia síntesis, ya que en complejos fotosintéticos de cloroplasto, así como en la CcO de levadura sucede. Adicionalmente, nuestros resultados preliminares muestran que dependiendo de la cepa de S. cerevisiae que utilicemos en el laboratorio, el efecto anteriormente descrito cambia dramáticamente: en ausencia de la subunidad Qcr7 Cob parece sintetizarse normalmente en un fondo nuclear mientras que en otro la síntesis de Cob disminuye dramáticamente. Nos interesa estudiar a qué se deben estas diferencias. 2) Síntesis de Cox1: Estudiaremos la función de los activadores traduccionales Mss51 y Pet309 sobre la síntesis de Cox1, y cómo esta síntesis se acopla al ensamblaje de la CcO con la participación de Pet54 y el propio extremo C-terminal de Cox1. Por un lado continuaremos estudiando cómo se asocian estas proteínas con el mRNA de COX1 y con el ribosoma. Pet309 es una proteína con motivos PPR cuyo mecanismo de acción aún se desconoce. Estudiaremos la función de estos motivos PPR mediante mutagénesis dirigida de la proteína. La finalidad es intentar identificar patrones de amino ácidos necesarios para su función. Continuaremos intentando identificar el sitio de unión de esta proteína al mRNA de COX1, ya que esta información es muy importante para comprender el mecanismo de acción de Pet309. Estudiaremos cómo se acopla la síntesis de Cox1 con su ensamblaje. Sabemos que la síntesis de Cox1 disminuye si se bloquea el ensamblaje de la CcO, y que el extremo C-terminal de Cox1 participa en dicha regulación. En el laboratorio contamos con mutantes puntuales del extremo C-terminal de Cox1. Durante el presente proyecto caracterizaremos a dichas mutantes e identificaremos aquellos amino ácidos que sean necesarios para regular la síntesis de Cox1. Finalmente, continuaremos con la caracterización de Pet54 como regulador positivo de la síntesis de Cox1. Pet54 se identificó originalmente como activador traduccional del mRNA de COX3, y como factor de procesamiento de un intrón en COX1. Nuestros datos previos demostraron que Pet54 tiene una tercera función regulando la síntesis de Cox1. Si bien no es esencial para este proceso, si parece favorecer la síntesis de Cox1.

El interés global de nuestro grupo es entender cómo se regula la traducción de mRNAs mitocondriales y cómo las proteínas recién sintetizadas se integran a la membrana interna de la mitocondria. Estos procesos son fundamentales para que la cadena respiratoria funcione correctamente. Los complejos respiratorios se conforman por subunidades codificadas en el DNA mitocondrial y el nuclear. Adicionalmente, estas enzimas poseen grupos prostéticos que deben incorporarse para que las enzimas sean funcionales. Sabemos que la biogénesis de los complejos respiratorios y de la ATP sintasa son muy complejos y que involucran muchos factores y chaperonas, la gran mayoría de ellos son específicos para cada complejo. A la fecha poco se comprende acerca de los procesos de ensamblaje de los complejos respiratorios. El conocimiento en este campo se ha generado principalmente por el uso de la levadura Saccharomyces cerevisiae como modelo. Gracias a la capacidad de manipulación genética tanto de su genoma nuclear como mitocondrial, ha sido posible descubrir proteínas involucradas en la biogénesis de complejos respiratorios. Muchas de las proteínas identificadas por primera vez en levadura han encontrado su ortólogo en humano años después (22). Tal vez del complejo del que más se conoce es la citocromo c oxidasa (CcO), último aceptor de electrones de la cadena respiratoria. Se han identificado más de 26 proteínas que se necesitan para coordinar la síntesis de subunidades mitocondriales, el ensamblaje con las subunidades importadas y la integración de grupos prostéticos, y que son exclusivas para la CcO (17). Por otro lado, desde hace más de dos décadas se han identificado proteínas que específicamente se requieren para la biogénesis del complejo III o bc1, en particular involucradas en fases iniciales de ensamblaje de este complejo. Sin embargo sólo hasta años recientes se ha comenzado a estudiar a fondo el mecanismo de ensamblaje de este complejo y se han descubierto nuevas chaperonas específicas (4,5). En todos estos casos, muchos de los ortólogos en humano de estas chaperonas se han asociado a miopatías mitocondriales, y a través de su estudio se ha comenzado a identificar que los mecanismos que regulan la biogénesis de los complejos bc1 y CcO son muy similares entre levadura y humano (22-24). En el presente trabajo nos interesa estudiar cómo se regula la síntesis de las subunidades mitocondriales citocromo b (Cob) y Cox1, que son el núcleo catalítico y de ensamblaje de los complejos bc1 y CcO, respectivamente. También nos interesa contribuir a comprender cómo este proceso que es central en el control de la expresión de genes mitocondriales se acopla a el ensamblaje de estas proteínas en la membrana interna mitocondrial. Cada vez se cuenta con más ejemplos en que la síntesis de una subunidad codificada en el genoma mitocondrial se regula por ensamblaje del complejo respiratorio (8,15,25). En algunos casos esta regulación depende de la propia subunidad mitocondrial, como es el caso de Cox1 en mitocondrias (15). Por un lado nos interesa comprender mejor cómo el extremo carboxilo terminal de Cox1 regula su propia síntesis, descubrimiento que se reportó originalmente por nuestro grupo (15). Por otro lado nos interesa descubrir si este tipo de regulación se da para el citocromo b, ya que su extremo carboxilo terminal se localiza en una estrecha cercanía con la subunidad Qcr7, componente esencial del primer intermediario de ensamblaje (26). Los mRNAs producidos en la mitocondria no poseen una secuencia Shine-Dalgarno o siguen el mecanismo de escaneo ribosomal para seleccionar el sitio de inicio de traducción (2). A la fecha se desconoce el mecanismo por el que el ribosoma identifica el codón de inicio, tanto en humanos como en levadura. Se piensa que este proceso podría darse a través de los activadores traduccionales, proteínas que en levadura actúan sobre las regiones 5’-UTR de los mRNAs e interaccionan con el ribosoma mitocondrial. Sin embargo a la fecha se desconoce cómo funcionan estas proteínas. En este trabajo estudiaremos la función de Pet309 y Mss51, activadores traduccionales específicos del mRNA de COX1. Ambos tiene ortólogos en humano que podrían llevar a cabo actividades similares (22), aunque cabe mencionar que los mRNAs de mitocondrias de humano no poseen extremos 5’-UTR. Si el tiempo lo permite, también nos interesa comenzar estudiar la función de la proteína Cbp1, necesaria para la traducción del mRNA de COB (9). Cbp1, junto con Pet309 pertenecen a la familia de proteínas con motivos PPR. Este tipo de proteínas tienen papeles esenciales en la biogénesis y función de mitocondrias y cloroplastos, y se encuentran presentes en todos los eucariotes analizados a la fecha. Sin embargo, después de 13 años de su descubrimiento, poco se comprende de la función de dichas proteínas. Sabemos que Pet309 y Cbp1 interaccionan físicamente en un complejo de alto peso molecular (27), pero a la fecha poco entendemos de su funcionamiento o de cómo seleccionan su mRNA blanco. Por ello llevaremos a cabo mutagénesis dirigida en estas proteínas para identificar amino ácidos que sean esenciales para su funcionamiento. De igual manera continuaremos caracterizando la naturaleza de la asociación de Pet309 y Mss51 con el mRNA de COX1 y con el ribosoma mitocondrial.