En células animales y levaduras, existen microdominios membranales especializados los cuales juegan un papel muy importante para el reclutamiento de proteínas, en la transducción de señales, en la endocitosis o infección por patógenos. Estos se han denominado “balsas lipídicas” (lipid rafts), término que se usa para describir pequeñas regiones membranales enriquecidas en esteroles y esfingolípidos; sin embargo, esta definición se basa en la propiedad de las membranas de formar fases ordenadas y aisladas debido a su insolubilidad en detergentes no iónicos (DRM) a bajas temperaturas. Recientemente, se ha sugerido que los lípidos juegan un papel muy importante durante el crecimiento polar en plantas (Fischer, et al; 2004: Curr Opin Plant Biol 7. 670-6). Además, en células vegetales se han identificado proteínas que presentan modificaciones tales como glicosil fosfatidil inositol (GPI), a las cuales se les ha asociado fuertemente con balsas lipídicas. Dado que los estudios proteómicos en raíces de plantas también demuestran la presencia de proteínas con modificaciones del tipo GPI, la presencia de balsas lipídicas en los pelos radicales y su relación con el crecimiento polar parece evidente. Recientemente, se han aislado fracciones de DRM en hojas de tabaco y el análisis de la composición demuestra que existe una composición lipídica similar a la presente en las balsas lipídicas. Mientras que en animales y hongos las balsas lipídicas son abundantes en colesterol y ergosterol, en las plantas existen abundantes esteroles como sitosterol y estigmasterol, al menos en Arabidopsis thaliana (Borner, et al; 2003: Plant Physiol 132, 568-77). A pesar de que los datos reportados demuestran la existencia de balsas lipídicas tanto in vivo como in vitro, aún existen dudas de si los métodos utilizados para su extracción modifican las propiedades con las que se podrían encontrar in vivo. Estas dudas se basan en que los métodos experimentales utilizan Triton X-100, un detergente que por sí solo puede promover la formación de agregados lipídicos a bajas temperaturas. En este proyecto proponemos la utilización de métodos directos para visualizar las balsas lipídicas in vivo. Para lograr este objetivo utilizaremos esfingolípidos o colesterol derivatizados con un marcador fluorescente, los cuales se han reportado que en células animales tienen la capacidad de incorporarse a las balsas lipídicas. De esta forma podremos visualizar los microdominios membranales in vivo por microscopía de fluorescencia y confocal y estudiar su contribución al mantenimiento del crecimiento polar durante las distintas fases de crecimiento del pelo radical, tales como iniciación, elongación y maduración. También será fundamental determinar la relación de los microdominios membranales con otros factores que determinan el crecimiento polar como el citoesqueleto, el calcio intracelular y las especies reactivas de oxígeno (ROS), y de esta manera estudiar su papel durante la reorganización morfológica que experimenta el pelo radical para permitir la formación del hilo de infección durante la asociación simbiótica.

En este trabajo proponemos estudiar los microdominios membranales o balsas lipídicas in vivo en los pelos radicales de leguminosas mediante el uso de lípidos o colesterol marcados de manera fluorescente. Aunque estos compuestos se han utilizado ampliamente para el estudio de microdominios membranales en células animales, hasta la fecha no existen reportes sobre la utilización de estas sondas fluorescentes en células vegetales. El uso de estas sondas fluorescentes permitirá el estudio de los microdominios lipídicos durante las distintas fases de crecimiento del pelo radical y durante la respuesta de estas células a los FNs, así como durante la formación del hilo de infección. El crecimiento polar en los pelos radicales esta finamente regulado por la organización del citoesqueleto, gradientes de calcio y especies reactivas de oxígeno (ROS), por lo tanto también resulta importante el estudio de estos factores y su participación en el mantenimiento y distribución de los microdominios lipídicos. Para esto se utilizarán enfoques de frontera, tales como la generación de plantas transgénicas de Lotus que expresan el transgen que codifica para una proteína sensible a ROS o calcio intracelular. Dado que el rizobia que infecta frijol produce exactamente los mismos FNs que los que nodulan Lotus, podremos utilizar a esta leguminosa como un modelo alterno, ya que Lotus puede ser transformado de manera estable. La contribución más grande del proyecto será sin duda poder observar los microdominios lipídicos o balsas lipídicas en los pelos radicales vivos y saber su papel en el mantenimiento del crecimiento polar, así como su reorganización durante la formación del hilo de infección en el establecimiento de la simbiosis. Esto es un área de frontera y sin duda alguna los resultados obtenidos serán publicables en revistas de impacto internacional. Por otro lado, en la formación de los recursos humanos, se espera graduar por lo menos a un estudiante de maestría y a uno de doctorado, así como a un estudiante de licenciatura.