El funcionamiento del cerebro requiere del aporte continuo de glucosa. Cuando éste se interrumpe puede presentarse daño neuronal irreversible en regiones del cerebro vulnerables. La isquemia cerebral focal (causada por la occlusión de la arteria cerebral media) y global (infarto al miocardio) es una causa frecuente de muerte e incapacitación permanente. La hipoglucemia cerebral es un importante componente de la isquemia, que contribuye a la muerte de las neuronas (3). Otra condición asociada a la disminución del suministro de glucosa al cerebro, es la hipoglucemia. Estados de hipoglucemia severa pueden presentarse en el ser humano como una complicación seria en pacientes con diabetes mellitus tipo 1 sometidos a tratamiento intensivo con insulina, ó en pacientes con diabetes avanzada de tipo II (32). Se ha reportado que pacientes diabéticos pueden presentar períodos de hipoglucemia sintomática dos veces por semana y de hipoglucemia severa una vez por año (32) poniéndolos en riesgo de presentar daño cerebral severo y permanente (33, 34). La administración excesiva de insulina es el principal factor de riesgo de hipoglucemia en los pacientes diabéticos. Si se llega a presentar un periodo de coma hipoglucémico de mas de 30 min, ocurre muerte neuronal en regiones cerebrales vulnerables como el hipocampo y la corteza (33) Los mecanismos de daño inducidos por la hipoglucemia severa no se conocen completamente. Al inicio se consideró a la muerte necrótica inducida por la liberación de aspartato y glutamato como el mecanismo principal de muerte (4,5). Mas tarde se mostró evidencia de muerte apoptótica (7), pero aún se desconoce el papel de la autofagia. La autofagia ocurre de manera natural en las células como un mecanismo degradativo lisosomal que recicla macromoléculas y organelos dañados (8, 18). Cuando se presenta de manera excesiva puede dar lugar a la muerte, y se ha descrito su contribución a la muerte retardada asociada con la isquemia cerebral (11-13). La autofagia también puede fungir como un mecanismo de protección capaz de proveer nutrientes alternativos a las células (10, 14-16), y de contribuir a la degradación de proteínas acumuladas ó mal plegadas que se asocia con algunas enfermedades neurodegenerativas (20, 24). La acumulación de proteínas mal plegadas o no plegadas, induce estrés del retículo endoplásmico (25). Se ha descrito una relación entre la autofagia y el estrés del retículo endoplásmico, proponiendo a la autofagia (al igual que la apoptosis) como un mecanismo de muerte subsecuente al estrés reticular (14, 26). Se desconoce si la autofagia participa como un mecanismo de protección ó de muerte neuronal en condiciones de hipoglucemia, y si en esta condición existe una relación entre el estrés reticular y la autofagia en el sistema nervioso. En el presente proyecto nos proponemos caracterizar la presencia de autofagia en neuronas cultivadas de corteza cerebral sometidas a la privación de glucosa, y en el cerebro (hipocampo y corteza) de ratas hipoglucémicas inyectadas con insulina. En el cultivo neuronal estudiaremos el papel de la autofagia en la muerte neuronal y su posible relación entre la autofagia y el estrés del endoplásmico. Por otra parte, hemos observado tanto in vivo como in vitro, que el cuerpo cetónico beta-hidroxibutirato (BHB) previene eficientemente la producción de especies reactivas de oxígeno, la lipoperoxidación y la muerte neuronal (41 y datos no publicados), por lo que investigaremos si el mecanismo de protección del BHB está relacionado con la modulación de la autofagia.

El proyecto contribuirá al conocimiento de los mecanismos que dan lugar a la muerte neuronal inducida por la ausencia de glucosa, y eventualmente a identificar blancos terapéuticos y diseñar nuevos tratamientos orientados a prevenir el daño neuronal asociado con la isquemia ó la hipoglucemia. La glucosa es el principal nutriente en el cerebro y cuando su aporte sanguíneo se interrumpe debido a la isquemia cerebral, ocasionada por la presencia de un coágulo, se produce muerte neuronal severa que incapacita de forma permanente de los pacientes. La isquemia cerebral es la tercera causa de muerte en países industrializados, y en nuestro país la enfermedad cerebrovascular es la sexta causa de muerte de acuerdo al INEGI (31). Dado los altos costos económicos que representa el mantenimiento y rehabilitación de los pacientes, se hace necesario aumentar nuestros conocimientos acerca de los mecanismos que llevan a la muerte neuronal en esta condición patológica y proponer alternativas terapéuticas para prevenirla. A la fecha no se pueden contrarrestar eficientemente las consecuencias neurológicas de los accidentes vasculares cerebrales permaneciendo importantes secuelas en los individuos afectados. La hipoglucemia es un componente importante de la isquemia cerebral que contribuye al daño neuronal. La hipoglucemia severa también puede presentarse en el ser humano como una complicación seria en pacientes con diabetes mellitus tipo 1 sometidos a tratamiento intensivo con insulina, ó en pacientes con diabetes avanzada de tipo II (32). Se ha reportado que pacientes diabéticos pueden presentar períodos de hipoglucemia sintomática dos veces por semana y de hipoglucemia severa una vez por año poniéndolos en riesgo de presentar daño cerebral severo y permanente (32-34). En niños y adolescentes la recurrencia de hipoglucemia severa es mayor, y estudios epidemiológicos señalan que pueden presentarse entre 5 y 20 eventos de coma hipoglucémico por cada 100 pacientes por año (35). Evidencia experimental sugiere la presencia de un déficit cognitivo en animales que fueron sometidos a un período de hipoglucemia severa (36, 37), ó a hipoglucemia recurrente (38), relación que también se ha sugerido en pacientes diabéticos con terapia insulínica (39, 40). Los mecanismos de la muerte neuronal hipoglucémica no se conocen totalmente. Un mecanismo necrótico de muerte fue sugerido por estudios pioneros (4-5), aunque posteriormente se identificó también la presencia de muerte neuronal programada de tipo I ó apoptosis (7). Más recientemente se ha identificado la presencia de marcadores de autofagia en modelos in vivo de isquemia y de privación de glucosa y oxígeno in vitro. Sin embargo aún existe controversia acerca del potencial papel protector ó inductor de la muerte de la autofagia (9-14). Hasta donde conocemos, en el caso de la hipoglucemia, no se ha caracterizado la presencia de la autofagia, ni su posible papel en la muerte inducida por esta condición. El presente proyecto tiene como objetivo caracterizar la presencia de autofagia durante la ausencia de glucosa y durante su reintroducción, en un modelo in vitro en neuronal cultivadas de corteza cerebral y en un modelo in vivo de hipoglucemia inducida por la administración de insulina en la rata. Durante el proyecto IN211710 financiado por PAPIIT, hemos investigado la activación de proteasas relacionadas con la necrosis como las calpaínas, que son proteasas de cisteína activadas por calcio, y de caspasas que son proteasas relacionadas con la apoptosis. De acuerdo a nuestros resultados, la calpaína se activa rápidamente después de retirar la glucosa del medio de cultivo en neuronas de hipocampo y de corteza cerebral, sugiriendo la muerte necrótica de las células (Páramo et al. en preparación). Por otra parte, la activación de la caspasa-9 y de la caspasa-3, relacionadas con la vía mitocondrial de la apoptosis, no se ha podido detectar en estas condiciones (tesis de maestría de Marlene Rivera), pero sí la actividad de la caspas-12 y de la caspasa-7. Aparentemente, la actividad de estas caspasas está asociada con el estrés del retículo endoplásmico, y con la activación de la calpaína, sugiriendo una intrincada relación entre los ejecutores de los distintos tipos de muerte celular (García de la Cadena et al. en preparación). También hemos observado marcadores de autofagia, como la presencia de vesículas positivas a la monodencil cadaverina, que es un marcador de vesículas autofágicas, y la presencia de la proteína LC3-II, característica de la autofagia (tesis de maestría de Cristina Gerónimo Olvera). Además, parte de la muerte neuronal se previene por el inhibidor de la PI3K de tipo III, 3-MA, por lo que creemos que la autofagia puede jugar un papel en la muerte de las neuronas sometidas a la privación de glucosa, ó bien fungir como un mecanismo de autoprotección ante la falta de nutrientes. Identificar el papel de este proceso en los modelos experimentales que tenemos implementados en el laboratorio, contribuirá a identificar moléculas que participen en la autofagia como posibles blancos terapéuticos. Por otra parte, recientemente se ha sugerido una relación entre la autofagia y el estrés del retículo endoplásmico. Experimentos de nuestro laboratorio han identificado la presencia de estrés del retículo endoplásmico en neuronas de hipocampo cultivadas, sometidas a la ausencia de glucosa. Aunque no conocemos si el estrés reticular se desata también en las neuronas de corteza, es posible que esto ocurra y que este proceso esté relacionado con la autofagia. Tanto el estrés del retículo como la autofagia pueden dar lugar a la muerte neuronal, por lo que investigar la relación entre ambos procesos contribuirá a entender la secuencia de eventos que conducen a la muerte e identificar sus ejecutores. Por último hemos observado que los cuerpos cetónicos previenen notablemente el daño oxidativo inducido por la hipoglucemia ó la inhibición metabólica tanto in vivo como in vitro (41). Recientemente hemos encontrado una protección notable del beta-hidroxibutirato en contra de la muerte inducida por la hipoglucemia in vivo (datos no publicados). Es importante determinar los mecanismos responsables de este efecto protector, ya que la administración de beta-hidroxibutirato puede resultar en la prevención del daño isquémico. Recientemente se ha propuesto este compuesto como posible tratamiento para algunas enfermedades neurodegenerativas que cursan con alteraciones en el metabolismo energético cerebral como la enfermedad de Huntington (42). Los resultados que se obtengan de esta investigación serán difundidos través de su publicación en revistas arbitradas de circulación internacional y de su exposición en congresos y conferencias. Considero que serán de interés tanto para la comunidad científica del área como para los neurólogos clínicos interesados en la implementación de nuevos tratamientos terapéuticos para el daño isquémico e hipoglucémico.