La fecundación es un proceso esencial para la reproducción sexual. Para el espermatozoide, el movimiento flagelar es la función fundamental. En caso de los mamíferos, el espermatozoide recorre un largo camino en los tractos genitales masculino y femenino para fecundar al óvulo. A pesar de que el espermatozoide no tiene capacidad de transcribir ni traducir, esta célula altera el patrón de movimiento flagelar respondiendo a distintos estímulos fisiológicos como cambios en la composición iónica, el pH y a sustancias químicas particulares (ligandos). Por lo anterior, el espermatozoide requiere una regulación precisa de la movilidad ya que cualquier falla tiene repercusiones directas, como la esterilidad masculina. El movimiento del flagelo depende de una maquinaria compleja llamada axonema. Una alteración en los componentes del axonema afecta severamente la movilidad del espermatozoide. Por otro lado, existen factores externos al axonema que alteran el patrón del batido flagelar. El Ca2+, H+ (pH), AMP cíclico (AMPc), ATP/ADP y la fosforilación pueden considerarse como éstos agentes reguladores. Ratones transgénicos con mutaciones en proteínas que modulan estos factores son infértiles: CatSper (canal de Ca2+), sNHE (intercambiador de Na+/H+ del espermatozoide), sAC (adenilato ciclasa soluble), GAPDHS (gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa) y PKA C alfa 2 (dominio catalítico alfa 2 de PKA). Los experimentos de células tratadas con detergente han mostrado que estos factores modulan directamente la actividad del axonema. Sin embargo, en la célula intacta, la regulación es más complicada debido a que estos interactúan generando una dinámica espacio-temporal compleja. Por lo anterior, el objetivo general del proyecto es dilucidar el mecanismo de regulación de la movilidad del espermatozoide de mamíferos correlacionando tres factores intracelulares: Ca2+, pH y AMPc. Para esto, proponemos tres objetivos particulares. 1) Analizar la correlación entre la concentración de Ca2+ intracelular y el patrón de movimiento en el espermatozoide de humano usando, Indo-1, un indicador químico de Ca2+. 2) Analizar la movilidad y el nivel de Ca2+ en las mitocondrias del espermatozoide con ratones transgénicos que expresan un indicador de Ca2+ genéticamente codificado (indicador proteico de Ca2+). 3) Estudiar la función del intercambiador Na+/H+ del espermatozoide (sNHE). En cada objetivo particular, aplicaremos métodos novedosos para realizar los experimentos. Particularmente, en el segundo objetivo, invertiremos nuestro esfuerzo para crear líneas de ratones transgénicos que expresen un indicador de Ca2+ compuesto por una proteína de las mitocondrias del espermatozoide. Utilizando una línea del animal transgénico, analizaremos el comportamiento del espermatozoide en los tractos genitales, cuyo conocimiento tendrá un gran impacto en el campo de investigación de la reproducción. Actualmente, la infertilidad humana se ha convertido en un problema social importante y el número de parejas que utilizan métodos de fecundación asistida ha incrementado. Sin embargo, la aplicación no adecuada de algunas técnicas podría causar acumulaciones de genes defectuosos en la sociedad humana. A largo plazo, los datos obtenidos en nuestro proyecto contribuirán a establecer la aplicación adecuada de las técnicas de fecundación asistida para evitar la acumulación de los genes defectuosos en el genoma humano.

La fecundación es un proceso esencial para las especies que se reproducen de manera sexual incluyendo el humano. Actualmente, la infertilidad es un problema social importante y está incrementando el número de parejas que utilizan algún método de fecundación asistida. El avance significativo en la técnica de fecundación asistida permite tener descendencia, aún a pacientes que tienen un problema en la movilidad de los espermatozoides, mediante la inyección del espermatozoide al ovocito por micro-manipulación, técnica llamada ICSI (Intra-Cytoplasmatic Sperm Injection). Debido a que el flagelo del espermatozoide y los cilios de las células somáticas comparten la mayoría de las proteínas del axonema, un paciente que tiene un defecto en la movilidad del espermatozoide podría tener una alteración genética que también afecte la función de los cilios. Por lo anterior, el uso de ICSI potencialmente causa una acumulación de genes defectuosos para la función de axonema. Desde este punto de vista, es importante estudiar el mecanismo de regulación de movilidad del espermatozoide no solamente para aumentar el conocimiento en ciencia básica, sino para establecer el uso adecuado de la técnica ICSI en las clínicas de fecundación asistida y evitar la acumulación de mutaciones genéticas en humanos, problema que antes no era frecuente. Por otro lado, en el presente proyecto, aplicaremos varios métodos nuevos para realizar experimentos difíciles que no se han aplicado anteriormente en el campo de la reproducción. Por lo anterior, esperamos obtener nuevos conocimientos que contribuirán a entender el mecanismo de regulación de movilidad del espermatozoide y con ello explorar otros métodos novedosos, los cuales contribuirán no solamente en el campo de reproducción sino también a campo de la fisiología de los cilios y a la bioquímica general. En el primer objetivo particular, usaremos un LED (light-emitting diode) de rango UV (340 nm) para excitar el indicador de Ca2+, indo-1, de manera estroboscópica. El registro de imágenes fluorescentes del espermatozoide de humano con indo-1 en dos longitudes de ondas de manera simultánea nos permitirá determinar el valor absoluto de la concentración de Ca2+ intracelular y el patrón de movimiento flagelar. Con esta estrategia, esperamos obtener datos muy importantes para entender el mecanismo de la regulación de la movilidad del espermatozoide de humano. También, este método serviría para medir el Ca2+ intracelular de los cilios. Comparando con especies de la fecundación externa como el erizo de mar, en mamíferos, es difícil observar el proceso de la fecundación, el cual se lleva a cabo dentro del tracto genital femenino. Además, los espermatozoides de mamífero requieren un proceso de maduración en el epidídimo, un órgano asociado al testículo, para obtener la capacidad de moverse. Nosotros determinaremos, por primera vez, el nivel de Ca2+ mitocondrial del espermatozoide de ratón y su patrón de la movilidad en el oviducto y en el epidídimo (por lo menos el nivel de Ca2+) creando una línea de ratones transgénicos que expresa un indicador fluorescente de Ca2+ genéticamente codificado, GEM-GECO. Aunque la concentración de Ca2+ en la matriz mitocondrial es distinto a la del citoplasma, se ha reportado que la dinámica de los cambios de Ca2+ en los dos compartimientos es parecida, por lo que los valor de Ca2+ mitocondrial serviría como una referencia relevante para estimar la concentración de Ca2+ intracelular. Por otro lado, el éxito de esta estrategia estimularía al campo de la reproducción y provocaría nuevos proyectos parecidos debido a que existen una variedad de indicadores fluorescentes para distintos parámetros fisiológicos que están involucrados en la regulación de la movilidad del espermatozoide como pH, AMPc, ATP/ADP y fosforilación. Por otra parte, el estudio bioquímico del dominio de unión a los nucleótidos cíclicos (CNBD) del sNHE nos proporcionará una evidencia importante sobre la cascada de señalización para lograr un incremento del pHi, lo cual proporcionará información importante sobre la regulación de CatSper en el mamífero. En caso de que exista la función esperada del dominio CNBD del sNHE de ratón, el sNHE seria una nueva familia de proteínas con un CNBD funcional, además de las ya reportadas, como cinasas (PKA y PKG), canales (CNG y HCN) y un intercambiador de guanín nucleótidos (EPAC) en mamífero, lo cual proporcionaría un impacto grande en el campo de la bioquímica. Para ensayos de unión, aplicaremos un método nuevo usando una proteína marcada con una proteína fluorescente y un análogo fluorescente del AMPc y la técnica de FRET (transferencia de energía entre dos fluoróforos cercanos). La técnica que desarrollamos es sensible, además, sencilla comparando a las otras técnicas de fluorescencia. El mismo principio se puede aplicar a otros estudios de interacción molecular como entre un ligando y su receptor, por lo que contribuirá al campo de la bioquímica de manera significativa.