Con el propósito de incrementar nuestro conocimiento sobre la cascada de transducción de señales activada en el pelo radical de leguminosas (frijol) incubados con factores Nod, el presente proyecto aborda el análisis de la interacción entre PvSymRK y PvSINA6 (ver apartado LOGROS DEL PROYECTO VIGENTE IN221209), así como la identificación de otros posibles interactores de este receptor. Se plantean diferentes aproximaciones experimentales._x000D_ Por un lado, será importante determinar la co-expresión y colocalización de PvSymRK y PvSINA6 en pelos radicales de frijol, así como la caracterización functional de PvSINA6 a través del análisis del fenotipo asociado al silenciamiento (RNAi) de este gene y/o uso dominantes negativas (carentes del dominio RING o del dominio SINA) en comparación con la sobre-expresión de PvSINA6. Igualmente nos proponemos determinar la especificidad de la interacción entre PvSymRK y PvSINA6 mediante ensayos de BiFC y sistema de dos híbridos en levadura usando combinaciones de dominios cinasa de otros receptores y otros miembros de la familia PvSINA identificados. Por otro lado, nos planteamos la caracterización bioquímica de la interacción a través de ensayos de co-inmunoprecipitación, inmuno-detección de ubiquitinación, transfosforilación in vitro, entre otros._x000D_ Respecto a la identificación de otros posibles interactores de PvSymRK, proponemos una estrategia en dos etapas: 1) diseño, expresión in planta y caracterización del receptor quimérico AtCERK1-PvSymRK-cMyc (HA u otra etiqueta) constituído por el ectodominio (región extracelular que une quitina) del receptor de quitina de A. thaliana CERK1 fusionado a las regiones yuxtamembranal y cinasa (intracelular) de de PvSymRK. El diseño postula que la incubación en presencia de quitina activará el dominio cinasa de la quimera AtCERK1-PvSymRK-cMyc (expresado en pelos radicales raíces transgénicas). 2) co-inmunoprecipitación (“pulldown” con anticuerpos anti-cMyc o etiqueta correspondiente) de complejos proteícos asociados al receptor AtCERK1-PvSymRK-cMyc (activado por incubación con quitina) e identificación de componentes del complejo mediante LC-MS/MS (cromatografía líquida acoplada a esprectrómetros de masas capaces de producir espectros en tandem). De encontrar comprometida la funcionalidad del receptor quimérico AtCERK1-PvSymRK-cMyc o incapacidad de activación de la cinasa, alternativamente nos hemos planteado realizar los experimentos de “pulldown” y proteómica utilizando la versión PvSymRK-cMyc (utilizada por nuestro grupo en un estudio previo). La secuencia o identidad de los posibles interactores encontrados con esta estrategia nos indicará los pasos a seguir para el análisis bioquímico de interacción proteína-proteína._x000D_

Este proyecto incidirá en la caracterización de la interacción proteína-proteína entre PvSINA6 y el receptor PvSymRK, así como la identificación de otros potenciales interactores de este receptor. Es de mencionar que PvSINA6 es la tercera E3 ubiquitin ligasa identificada como asociada al proceso de nodulación. Las 3 proteínas tipo E3 ubiquitin ligasa han sido identificadas por ensayos de dos híbridos en levadura, pero poco se sabe sobre su bioquímica y biología celular en pelos radicales. Es en estas areas del conocimientos que esperamos contribuir. Las estrategias experimentales planteadas generarán conocimiento de frontera, no sólo en términos de las etapas iniciales de la relación simbiótica leguminosa:rhizobia, sino también en la comprensión de los mecanismos de transducción de señales mediados por receptores tipo cinasa. _x000D_ Otra contribución importante será la identificación de otros interactores de PvSymRK, lo cual va de la mano del desarrollo de una novedosa herramienta bioquímica-molecular: el diseño y caracterización de un receptor quimérico en términos de la activación de una cinasa que transduce una señal. Esperamos identificar el o los blancos de dicha actividad._x000D_