El presente proyecto es una continuación de un proyecto anterior apoyado por la DGAPA, cuyo objetivo es identificar los mecanismos moleculares responsables de la inhibición de la entrada de calcio y la reducción del AMPc durante la mitosis. Desde hace años se había demostrado experimentalmente que durante la mitosis, tanto la entrada de calcio, como la producción de AMPc estaban inhibidas. Hasta el dia de hoy se desconoce el mecanismo molecular responsable de esta inhibición. Durante el desarrollo del proyecto anterior apoyado por la DGAPA, nuestro grupo de trabajo demostró que existe una asociación física (proteína-proteina) y funcional entre el canal Orai (responsable de la entrada de calcio inducida por agonistas acoplados a la via de IP3) y la adenilato ciclasa 8 (trabajo que tenemos en prensa en la revista Science). El resultado de esta asociación es la modulación sincronica del calcio intracelular y el AMPc, ya que el calcio que ingresa a la célula mediante el canal Orai es el que activa a la adenilato ciclasa 8 (AC8). En esta asociación juegan un papel muy relevante el citoesqueleto celular y los microtúbulos, como tambien demostramos recientemente (trabajo en prensa en la revista Cell Science). En el presente proyecto estudiaremos esta asociación fisica y funcional entre Orai y AC8 durante la mitosis. Resultados preliminares indican que durante la mitosis existe una internalización simultanea de Orai y AC8, las cuales se relocalizan en vesículas subcorticales adyacentes a la membrana plasmática. Este hallazgo cobra particular importancia en astrocitos de la corteza, ya que en este tipo celular la principal AC que se expresa es la AC8, y el canal Orai constituye la principal fuente de entrada de calcio en respuesta a agonistas acoplados a proteinas G y la vía de IP3. Por este motivo, utilizaremos cultivos primarios de astrocitos para este estudio. _x000D_ Para poder estudiar la relocalización de AC8 y Orai en células vivas, hemos desarrollado una variedad de proteinas de fusion entre AC8 y Orai con proteinas fluorescentes de diferentes longitudes de emisión, con el fin de poder localizar AC8 y Orai de manera simultanea en la célula, ademas de poder realizar estudios de transferencia resonante de energia fluorescente (FRET). Así mismo, hemos desarrollado un equipo de microscopia de alta resolución (que hemos denominado nanoscopio), el cual nos permite estudiar asociaciones proteicas con una resolución menor a 10 nanómetros, es decir, una resolución alrededor de 25 veces mejor que el limite de difracción de la luz (resolución típica de un microscopio confocal comercial). _x000D_ El apoyo de la DGAPA ha sido esencial para el desarrollo de todas estas herramientas moleculares y de óptica avanzada, las cuales nos han permitido responder preguntas muy puntuales sobre localización subcelular de proteínas y asociaciones de complejos moleculares con gran certidumbre y precision en células vivas y en tiempo real (con resolución de milisegundos). _x000D_ Igualmente hemos desarrollado una variedad de sensores moleculares de calcio y AMPc geneticamente codificados, los cuales nos permiten medir concentraciones de estos 2 segundos mensajeros en microdominios celulares de células vivas con gran resolución espacial y temporal. _x000D_ Creemos que con estos desarrollos metodológicos estamos en la posición de responder esta pregunta tan relevante sobre ciclo celular, la cual ha sido tema de gran discusión en los últimos años.

Sin lugar a dudas, el calcio y el AMP cíclico (AMPc) constituyen dos de los segundos mensajeros mas relevantes en la fisiológica de todas las células. Existen una plétora de eventos en los cuales participan uno o ambos mensajeros, desde la división celular, hasta la apoptosis, pasando por diferenciación celular, migración, etc. _x000D_ Durante años se ha sabido que tanto las concentraciones de calcio como de AMPc se reducen durante la mitosis en el ciclo celular. Esta regulación concertada a la baja de ambos mensajeros ha sido un misterio que no ha podido ser explicado a nivel molecular hasta el dia de hoy. Igualmente misterioso es el posible papel fisiológico que tenga la reducción, durante el ciclo celular, de estos dos segundos mensajeros tan importantes. _x000D_ El presente proyecto es la continuación de un proyecto anterior apoyado por la DGAPA que lleva por fin el determinar los mecanismo moleculares responsables de la regulación a la baja y sincrónica de calcio y AMPc durante la mitosis. _x000D_ Para poder responder a este complejo enigma, hemos tenido que desarrollar una gran cantidad de sensores moleculares de AMPc y calcio, así como metodologías de ultra resolución, entre las que se cuentan nuestro equipo de onda evanescente de ultima generación basado en transferencia de energía resonante (LG-TIRFM-FRET), el cual nos ha permitido reducir la resolución espacial de 600 nm de un confocal convencional, a menos de 10 nm con nuestro sistema. _x000D_ Durante el proyecto anterior demostramos que la adenilato ciclasa 8 se asocia al canal de calcio Orai, mediante un dominio que contiene los amino ácidos GRSS de la región amino terminal de la AC8. Este dominio permite la generación de AMPc eslabonada con la entrada de calcio a través del canal Orai. Este trabajo se encuentra en prensa en la revista Science. _x000D_ Igualmente, en el proyecto anterior demostramos el papel de las balsas lipídicas y del citoesqueleto cortical en esta asociación, formando lo que hemos denominado "corrales de AMPc" (trabajo en prensa en la revista Cell Science._x000D_ El presente trabajo va dirigido a estudiar la internacionalización de ambas proteínas durante la mitosis, lo cual ocasiona que no se eleve el calcio intracelular (vía el canal Orai) y tampoco se produzca AMPc (mediante la AC8 que también se internaliza con el canal Orai como un complejo).