El frijol (Phaseolus vulgaris), la leguminosa más importante para el consumo humano en el mundo. Lleva a cabo la fijación simbiótica de nitrógeno (N) producto de la asociación con bacterias del suelo: rhizobia. El rendimiento del cultivo de frijol es bajo, tanto por ataque de plagas e insectos como por estreses abióticos. El estrés por exceso de metales (Al, Cu, Mn) es frecuente en suelos ácidos de América Latina y África donde se cultiva frijol. Las respuestas de las plantas a la toxicidad por metales incluye varios procesos biológicos que requieren una regulación fina y precisa a distintos niveles como el transcripcional y el post-transcripcional, entre otros. Este proyecto plantea investigar el papel de los miRNAs como reguladores globales de la respuesta al estrés por toxicidad a metales en el frijol. Los miRNAs son una de las clases de RNAs pequeños (18-24 nt) que no codifican proteínas y que actúan en la regulación post-transcripcional en plantas y animales. Los miRNAs maduros incorporados al complejo de silenciamiento (RISC) que contiene la proteína AGO1 reconocen a su mRNA blanco por complementariedad de bases casi perfecta e inducen su degradación o, en algunos casos, inhiben su traducción. Los miRNAs de plantas se han vinculado tanto a procesos de desarrollo como a la respuesta/adaptación a distintos tipos de estrés. El conocimiento sobre miRNAs en el frijol, que es aún incipiente, ha surgido del trabajo pionero y en colaboración de grupos de la UNAM-Cuernavaca como el de F Sánchez (IBt), A Covarrubias (IBt), JL Reyes (IBt) y el mío propio (CCG). Este proyecto se fundamenta en nuestro trabajo previo orientado a definir aspectos relevantes sobre la regulación y la señalización que ocurren en la respuesta del frijol a estrés nutricional. Utilizamos enfoques globales de genómica funcional que nos permitirán entender las intrincadas redes regulatorias y los múltiples genes y proteínas involucrados en esa respuesta. Nuestra hipótesis de trabajo es que aquellos miRNAs y sus blancos que responden (inducción o represión) a una condición específica juegan un papel relevante en la señalización / regulación de dicha condición. El objetivo general es elucidar el papel de miRNAs de frijol en la regulación post-transcripcional de la respuesta / adaptación al estrés abiótico por toxicidad a metales. Para cumplir este objetivo se trabajará en dos vertientes, una general y una específica. La primera consistirá en analizar del perfil de expresión de miRNAs de frijol de plantas sometidas a toxicidad por Al y por Cu. La segunda vertiente consistirá en analizar el papel en la respuesta a metales de dos miRNAs candidatos: el miR398 y el pvu-miR1511, que se seleccionaron con base en la literatura y en nuestro trabajo previo. En el caso del miR398 se explorará también su papel en la interacción de la planta con patógenos y con rhizobia, condiciones en las que se genera estrés oxidativo. Para demostrar la función de cada miRNA planteamos usar la genética reversa: mediante la transformación genética se alterará la expresión de cada miRNA por ganancia o por pérdida de función en "plantas compuestas" de frijol con la raíz transformada por infección con Agrobacterium rhizogenes. Se analizará la alteración del fenotipo simbiótico y de la respuesta a metales en las plantas compuestas consideradas "mutantes", en comparación con plantas silvestres para así elucidar la función de cada miRNA en esos procesos.

CONTRIBUCION Este proyecto contribuirá a generar conocimiento sobre componentes esenciales para la compleja regulación de la respuesta del frijol (Phaseolus vulgaris) al estrés por toxicidad a metales. El frijol (Phaseolus vulgaris) es la leguminosa más importante para el consumo humano. La familia leguminosae (fabaceae) que es una de las más grandes e importantes de las plantas angiospermas, puesto que a través de su interacción con bacterias Rhizobiaceae (rhizobia) incorporan el nitrógeno (N) atmosférico a las cadenas tróficas; además aportan más del 40% de las proteínas que requiere el humano en su dieta diaria. El rendimiento del frijol es bajo debido a ataques de plagas e insectos y a diferentes estreses abióticos. Mejorar la adaptación a estreses abióticos e incrementar la fijación simbiótica de N deben ser objetivos prioritarios para lograr un mayor rendimiento de este importante cultivo. La fijación de N en plantas leguminosas así como su respuesta / tolerancia a estrés abiótico son procesos muy complejos que requieren de múltiples genes que involucran diferentes mecanismos e intrincadas redes regulatorias. Esto en contraste con otros procesos como la resistencia de las plantas a enfermedades la cuál puede depender de un solo gene, recesivo o dominante. La investigación con enfoques clásicos como el fitomejoramiento, no han brindado resultados relevantes para obtener mejor germoplasma de frijol con tolerancia a estrés abiótico. Consideramos imperativo desarrollar investigación con enfoques genómicos integrales para lograr una solución real y eficiente del complejo problema. Nuestro grupo del CCG-UNAM desarrolla investigación sobre genómica funcional de frijol tendiente a elucidar la compleja regulación que ocurre en la simbiosis con rhizobia y en la respuesta a estreses nutricionales. Hemos sido pioneros en esta área, hemos implementado una plataforma de genómica funcional que no existía para el frijol. Esta incluye: la transcriptómica, el perfil de expresión de reguladores globales (TF y miRNAs), la metabolómica y la genética reversa para definir funciones génicas. Hemos contribuido a generar conocimiento sobre la genómica funcional del frijol ante el estrés por deficiencia de P (7-10). Para ello el apoyo del PAPIIT ha sido esencial (IN211607, IN209710). Este proyecto se basa en la plataforma de investigación ya implementada en nuestro grupo. Se deriva de conocimiento previo, original, producto de nuestro trabajo. Aborda un área novedosa, de frontera y de gran interés actual en la biología de animales y de plantas: la regulación genómica post-transcripcional mediada por RNAs pequeños. Ya hemos hecho contribuciones al área de la regulación mediada por miRNAs en plantas (9-11). Fuimos los primeros que demostramos el papel de un miRNA en el frijol, el miR399 que participa en la respuesta a deficiencia de P (9). Nuestra contribución a esta área generó tres artículos internacionales en revistas reconocidas (New Phytologist, Plant Cell and Environment, Frontiers in Plant Science). Realizamos investigación en colaboración con colegas con experiencia en el área, tanto del IBt-UNAM, (JL Reyes, F Sánchez) como de instituciones del extranjero (CP Vance de la U. Minnesota/USDA). Considero que lo anterior le da viabilidad a este proyecto. El tema específico del proyecto: los miRNAs de frijol en el estrés por toxicidad de Al y de Cu, se desconoce totalmente. Este tipo de estrés es frecuente en suelos ácidos donde se siembra el frijol, en América o África, por lo que consideramos relevante estudiarlo para desentrañar los componentes relevantes que le permiten a la planta contender con él. Nuestra hipótesis considera que los miRNAs juegan papeles importantes en la regulación post-transcripcional de la respuesta del frijol a este estrés, pero hay que conocer cuáles miRNAs y cuál es su función precisa. Hay solamente una publicación sobre miRNAs que responden al estrés por toxicidad a Al en la leguminosa M. truncatula (19), ninguna para otras especies y ninguna para la respuesta a toxicidad por Cu en plantas. Consideramos imperativo abordar nuestras preguntas o problema con enfoques tanto generales como específicos. Planteamos definir el perfil de expresión de los miRNAs de frijol que responden a toxicidad por Cu y Al. Tenemos la experiencia para hacerlo por medio de hibridación de macroarrays de miRNAs conocidos (10). Ampliaremos la selección de miRNAs para el macroarray con base en lo reportado para M. truncatula sobre miRNAs que responden a Al (19). Además ahora contamos con la secuencia del genoma de frijol (http:://www.phytozome.net/commonbean, http://mazorka.langebio.cinvestav.mx/phaseolus/) lo que nos permitirá mejorar el macroarray de miRNAs incluyendo sólo miRNAs conocidos que sí están codificados en el genoma de frijol y que se haya detectado su expresión en previos análisis de secuenciación masiva (28). [NOTA: Estoy conciente que la secuenciación masiva de RNAs pequeños, que ha sido usada con éxito en frijol (28), es una herramienta muy poderosa para definir el perfil de expresión de miRNAs. Sin embargo es muy costosa y su financiamiento utilizaría gran parte de los recursos que otorga PAPIIT, lo que sería incompatible para realizar otros enfoques planteados. Además no dispongo de expertos que pudieran participar en el análisis de datos de la secuenciación masiva. Si consiguiera recursos adicionales para pagar el servicio Y el análisis de datos de secuenciación masiva sí la utilizaría para este proyecto]. Como enfoques específicos planteamos demostrar la función de dos miRNAs candidatos: el miR398 -conservado en diferentes plantas- y el pvu-miR1511 - probablemente solo de la tribu phaseolae- en la respuesta del frijol a toxicidad por Al y por Cu. Seleccionamos estos miRNAs con base en la hipótesis de que los miRNAs que responden (inducción o represión) a alto Al o Cu en la raíz o nódulos de frijol pueden tener un papel regulatorio importante para contender con ese estrés. Para demostrar la función de cierto gene se requieren enfoques genéticos. En frijol no existen bancos de mutantes por lo que una alternativa es la genética reversa en la que mediante la transformación genética se altera la expresión de un gene específico (sobre-expresión o silenciamento). Nosotros reportamos por primera vez para frijol el silenciamiento génico mediante RNAi (RNA de interferencia) en "plantas compuestas" con la raíz transformada por infección con Agrobacterium rhizogenes y así demostramos la función del TF PvPHR1 y del miRNA PvmiR399 (9, 33). Actualmente estamos usando la genética reversa para demostrar la función del miR172 en la nodulación de frijol (PAPIIT IN209710). La estrategia planteada para este enfoque específico es viable y, por experiencia propia, consideramos es idónea y para cubrir los objetivos. Este proyecto contribuirá, al igual que otros proyectos PAPIIT bajo mi responsabilidad, a la formación de recursos humanos. Dos estudiantes de doctorado de mi grupo son participantes del proyecto y se buscará incorporar a otro(s) estudiante(s) desde el inicio de su programa de posgrado.