Durante los últimos 10 años, nuestro grupo ha optimizado una plataforma tecnológica cuyos principales elementos son: A) Construcción de repertorios de fragmentos de anticuerpos recombinantes de origen humano en formato de cadena sencilla (scFv). B) Despliegue de ellos en la superficie de bacteriofagos de tipo filamentoso, constituyéndose entonces en bibliotecas de fago-anticuerpos. C) Tamizado racional de esas bibliotecas para la "selección" de anticuerpos específicos contra toxinas del veneno de alacranes mexicanos. D) Maduracíon in vitro de la afinidad y estabilidad funcional de los scFvs E) Caracterización estructural y funcional (afinidad y estabilidad) de dichos anticuerpos. F) Evaluación in vivo (en ratones), de su capacidad neutralizante tanto de las toxinas como de los venenos correspondientes. La optimización de cada uno de esos elementos nos ha permitido obtener a partir de un banco de 10 8 variantes construido con DNA amplificado del RNA de una muestra de sangre de un solo individuo, anticuerpos neutralizantes de las principales toxinas y de los venenos de las especies Centruroides noxius de Nayarit (toxina Cn2) y Centruroides suffusus suffusus de Durango (toxina Css2). Hemos generado variantes de dos precursores que reconocen sendos epítopes en esas toxinas. El anticuerpo mejor optimizado proveniente del precursor 3F, se llama LR y es capaz de neutralizar tanto a las toxinas mencionadas como a los venenos correspondientes. Hemos resuelto la estructura tridimensional de un precursor de LR llamado 9004G en complejo con la toxina Cn2. En el presente trabajo, nos proponemos llegar a la meta de obtener variantes del segundo precursor llamado C1 que sean capaces de neutralizar las toxinas ya mencionadas y a los respectivos venenos por medio de su pegado a un segundo epítope presente en dichas toxinas. Estos logros tendrán el fin de garantizar el efecto neutralizante de los anticuerpos obtenidos hacia el veneno durante un accidente por picadura de alacrán. Alternativamente, se propone construir un banco de fago anticuerpos de mayor talla a partir de muestras de sangre de un número significativo de individuos de diferentes razas. De este nuevo banco se aislarán anticuerpos que reconozcan epítopes diferentes al ya caracterizado. Todo ello con la finalidad de generar un antiveneno de origen humano equivalente al antiveneno comercial policlonal y polivante de caballo. La nueva información estructural nos ayudará a entender mejor la inhibición de la actividad de las toxinas del veneno de alacranes mexicanos y en ese sentido generar antivenenos de última generación.

Este proyecto es muy importante a nivel de generación de conocimiento respecto al entendimiento de: La interacción antígeno anticuerpo y la inhibición de la actividad de las toxinas sobre el canal de sodio. La determinación de nuevos epítopes neutralizantes permitirá entender mejor los propios procesos de interacción toxina-canal. Por otro lado es muy importante que México pueda contar con alternativas concretas para un importante problema de salud pública, como son las intoxicaciones por picadura de alacranes. Si bien actualmente son muy pocos los casos de muertes, gracias al antiveneno comercial equino, es posible que el uso frecuente de antivenenos de este origen a largo plazo pueda causar problemas por reacciones secundarias. Además, eventualmente se presentarán problemas regulatorios por el potencial riesgo de la transmisión de retrovirus y priones, además de la restricción del uso de animales para la producción de los anti-venenos. El contar con una fuente alternativa segura, en donde se puede optimizar y estandarizar la producción homogénea de antivenenos en fermentadores a diferencia de la dependencia de la respuesta inmune de cada caballo empleado es una garantía a un futuro cercano. La propuesta de trabajo se basa en nuestra experiencia positiva previa donde se contemplan dos estrategias que podrán ser ejecutadas de manera simultánea: 1. Maduración del scFv C1 por medio de evolución dirigida. Como se mencionó el scFv C1 se seleccionó del banco de anticuerpos humanos por su reconocimiento a la toxina Cn2 [12]. Tiene una baja afinidad, por lo cual no la neutraliza. Mediante ensayos de competencia en Biacore con el scFv 3F y sus derivados, detectamos que reconoce un sitio diferente en la toxina Cn2. Si logramos incrementar la afinidad por Cn2, mediante ensayos de neutralización en ratones comprobaremos si efectivamente es un epítope importante para la neutralización. Dada la reactividad cruzada de los anticuerpos y la alta identidad de la toxinas, paralelamente realizaremos tamizados contra la toxina Css2 2. Generación y tamizado de un nuevo banco de anticuerpos humanos con mayor diversidad. El primer banco no inmune fue generado a partir de una muestra de sangre periférica de un solo individuo. Alternativamente, se busca contar con una mayor diversidad de anticuerpos humanos y la estrategia es obtener muestras de sangre periférica de por lo menos 30 donadores humanos de diferentes razas. El tamaño esperado del banco es de aproximadamente de 1X109 variantes. De este nuevo banco, se harán rondas de tamizado con el sistema de despliegue en fagos. Dado que buscamos anticuerpos que reconozcan un sitio diferente al ya reportado en Cn2 y Css2[21], podremos bloquear este sitio con el anticuerpo LR, el resto de la superficie de la toxina quedará expuesta para ser reconocida por los nuevos anticuerpos. La estrategia es aplicable para ambas toxinas Cn2 y/o Css2. En ambos casos las variantes promisorias una vez caracterizadas (confirmado su capacidad de neutralización) pueden ser empleadas de manera simultánea para la neutralización de los venenos y permitirá establecer si la combinación de por lo menos dos anticuerpos diferentes son mas eficientes en la neutralización del veneno.