La ribonucleasa P (RNasa P) es, además del ribosoma, la única ribozima universal que se conoce. Este complejo ribonucleoproteico esencial difiere sustancialmente en su arquitectura en eucariontes y bacteria. La presente propuesta tiene dos objetivos principales. Uno de ellos es determinar la estructura cristalográfica de una nueva clase de ribonucleasas P compuestas únicamente de proteína. Estas proteínas, llamadas PRORPs, llevan a cabo la maduración del extremo 5' de las moléculas precursoras de tRNA, lo que contradice el dogma de que una subunidad de RNA lleva a cabo la actividad catalítica. Para este trabajo vamos a utilizar como modelo las proteínas PRORP de Arabidopsis thaliana en las que se ha caracterizado la actividad de la proteínas PRORP y se continuará con el análisis de otros blancos susceptibles de ser cristalizados. Nuestro laboratorio tiene experiencia en estudios estructurales de complejos de RNasa P y tRNA en bacteria y se enfocará en la determinación de la estructura de las proteínas PRORP en complejo con tRNA.

El segundo objetivo de esta propuesta es encontrar moléculas de bajo peso molecular que se unan a la subunidad proteica de la RNasa P bacteriana y que eventualmente afecten la función de la holoenzima. Utilizaremos una tecnología relativamente nueva que se conoce como diseño de fármacos basados en fragmentos (fragment based drug discovery). El principio básico de esta tecnología es la identificación experimental de compuestos de bajo peso molecular que tengan la capacidad de unirse a la molécula blanco e inhiban su función. En un siguiente paso se mejora la afinidad de estos compuestos modificándolos químicamente en base a la estructura cristalográfica del complejo proteína-ligando, o combinándolos con otra molécula pequeña que haya mostrado el efecto deseado. En la actualidad, esta estrategia se emplea ampliamente en investigación farmacéutica, dado su potencial de explorar espacios químicos muy extensos. No existen aún ejemplos en la literatura acerca de su aplicación para blancos de RNasa P.

La resolución de las estructuras tridimensionales de la(s) proteína(s) y complejos propuestos ayudarán a entender mejor las bases moleculares del reconocimiento proteína-RNA y proteína-ligando y ampliarán el conocimiento sobre el plegamiento y motivos estructurales de proteínas involucradas en reconocimiento de RNA, además de abrir una ventana a la posibilidad de desarrollar aplicaciones farmacéuticas que involucren este tipo de blancos. Los estudios incluirán una combinación de metodologías de biología molecular y bioquímica con objeto de producir y caracterizar los componentes biológicos requeridos, y de cristalografía de rayos X y bioinformática para resolver y analizar las estructuras obtenidas. Iniciaremos y continuaremos además en paralelo estudios estructurales sobre otros sistemas de nuestro interés como la glicil tRNA sintetasa, el sistema de regulación transcripcional PyrR y la glutamil tRNA reductasa. Esta estrategia proveerá una visión única y detallada a nivel atómico de los procesos biológicos involucrados con RNA.

El campo de investigación en RNasa P está bastante desarrollado a nivel mundial y ha sido extremadamente productivo. Desde el descubrimiento de esta molécula como ribozima universal hace casi 30 años (Guerrier-Takada et al., 1983) se han publicado más de mil artículos sobre el tema. La investigación sobre RNasa P ha sido galardonada con un Premio Nobel otorgado a Sidney Altman por el descubrimiento de las propiedades catalíticas del RNA. Desde entonces, la naturaleza ubicua de RNasa P como ente ribonucleoproteico con actividad de ribozima se ha tomado como un dogma. En este contexto, el descubrimiento de una RNasa P compuesta únicamente de proteína en mitocondrias humanas y en plantas ha sido crucial para el desarrollo de la investigación en RNasa P. El hecho de que las proteínas PRORP estén presentes en numerosos y diversos sistemas eucariontes hace que se requiera de una reconsideración completa de la historia evolutiva de la RNasa P en este dominio de la vida.

El descubrimiento y la caracterización de esta nueva clase de RNasaP compuesta únicamente de proteína es muy reciente (2008-2010). Por ello, el campo de investigación en estas enzimas se encuentra en una etapa embrionaria. La presente propuesta buscará, a través de estudios estructurales, obtener un entendimiento mucho más profundo en las funciones y el modo de acción de la RNasa P proteica. Estudios preliminares de cristalización han confirmado que las PRORPs son cristalizables, y aunque estos cristales no difractan aún a alta resolución, esto representa un resultado altamente prometedor.

Por otro lado, y en lo que respecta al subproyecto de búsqueda de inhibidores de RNasa P bacteriana, resulta paradójico el hecho de que aún no se hayan encontrado inhibidores naturales de esta ribozima, a diferencia de lo que se observa para el caso del ribosoma. Se ha propuesto que el carácter dinámico y flexible del complejo, que en parte impidió por muchos anos su cristalización, podría haber impedido la evolución de inhibidores específicos (Kirsebom, 2007). Incluso se ha mencionado que la subunidad proteica tiene ciertas características de una proteína intrínsecamente no estructurada, que impediría igualmente la unión estable de un ligando (Henkels et al., 2001). La realización de un estudio estructural más sistemático que los realizados anteriormente, como el que proponemos, contribuirá a iluminar estas interrogantes.

El Dr. Alfredo Torres Larios, responsable del presente proyecto, ha resuelto diversas estructuras cristalográficas tanto de proteínas como de complejos proteína-RNA, moléculas grandes de RNA y complejos proteína-ligando ((Torres-Larios et al., 2002), (Torres-Larios et al., 2003), (Dock-Bregeon et al., 2004), (Torres-Larios et al., 2005), (Fuentes-Silva et al., 2007), (Arreola et al., 2008), (Rodriguez-Almazan et al., 2008), (Zarate-Perez et al., 2009), (Reiter et al., 2010), (Garcia-Torres et al., 2011), (Canul-Tec et al., 2011)). El Dr. Torres cuenta además con una colaboración vigente en el Advanced Photon Source (APS) localizado en Argonne, USA, muy cerca de la ciudad de Chicago, a cuatro horas de vuelo de la Ciudad de México. Estas instalaciones cuentan con la mejor fuente de luz sincrotrón del continente y una de las mejores del mundo. Sus líneas de rayos X están optimizadas para proyectos de alto rendimiento, permitiendo la colecta de hasta 20 juegos de datos de cristales diferentes en 24 horas, lo que será vital para el desarrollo exitoso de nuestra investigación.

Resultados obtenidos que se enmarcan dentro del presente proyecto de investigación.

A continuación se mencionan brevemente los resultados relacionados al presente proyecto que se han publicado. Cabe resaltar que dichos trabajos se han publicado en revistas de muy alto impacto científico entre las que se encuentran Nature y Nature Structural Biology.

Artículo 1: Structural basis of translational control by Escherichia coli threonyl tRNA synthetase (Torres-Larios et al., 2002). En este trabajo, por medio de la cristalización del complejo de la treonil-tRNA sintetasa de E. coli y la región líder de su correspondiente mRNA, se define el mecanismo molecular mediante el cual esta enzima autorregula su propia expresión mediante represión traduccional.

Artículo 2: Crystal structure of the RNA component of bacterial ribonuclease P (Torres-Larios et al., 2005). En este trabajo se obtiene la estructura tridimensional del elemento de RNA que forma parte del complejo ribonucleoproteico de la ribonucleasa P de Thermotoga maritima. La ribonucleasa P es la ribozima encargada del procesamiento del extremo 5' terminal del RNA de transferencia. Este complejo, junto con el complejo ribosomal, es uno de los complejos más conservados evolutivamente y está presente en todos los organismos vivos.

Artículo 3: Expression, purification and preliminary X-ray diffraction studies of the transcriptional factor PyrR from Bacillus halodurans (Arreola et al., 2008). Recientemente hemos resuelto la estructura tridimensional de la proteína PyrR de B. halodurans en dos grupos espaciales. Este estudio nos permitió definir la composición oligomérica de la proteína en ausencia de RNA y demuestra la factibilidad de la realización de estudios estructurales en este sistema. Actualmente nos encontramos en el proceso de caracterización de los complejos proteína-RNA para proceder a su cristalización.

Artículo 4: Structure of a bacterial ribonuclease P holoenzyme in complex with tRNA (Reiter et al., 2010). En este trabajo fui responsable de la producción, caracterización y cristalización del complejo ternario formado por la holoenzima de RNasa P, un complejo ribonucleoproteico de 125 kDa y el producto tRNA. Este artículo representa un avance científico y técnico sustancial que permitió definir el proceso de reconocimiento y el posible mecanismo de corte del pre-tRNA.

Contamos además con dos proyectos en curso en donde hemos encontrado, por medio de la estrategia basada en búsqueda de fragmentos propuesta en el presente proyecto, inhibidores de la actividad de la triosafosfato isomerasa de Trypanosoma cruzi y de la neuraminidasa H1N1 del virus de la influenza humana (proyecto apoyado por PAPIIT IN202910). Tesis de Maestria en Ciencias Bioquímicas de Marco Igor Valencia Sanchez terminada. Las publicaciones de los resultados obtenidos se encuentran en preparación, asi como un registro de patente en curso.