El proyecto que ahora se presenta es en gran medida la continuación del proyecto que me fue apoyado por el PAPIIT para ejercerse de 2010 a 2012. El objetivo general es aportar datos sobre los mecanismos de muerte neuronal, en relación con la hiperexcitabilidad, la apoptosis, el metabolismo energético mitocondrial, la fuente de ROS y la transmisión sináptica inhibidora, mediante experimentos in vivo, en la médula espinal y en el hipocampo de la rata. Uno de los mayores problemas actuales de las neurociencias es entender los mecanismos celulares y moleculares de la neurodegeneración, conocimiento sin el cual no será posible diseñar estrategias terapéuticas eficaces para las devastadoras enfermedades neurodegenerativas, para las cuales no existe ningún tratamiento efectivo. Este proyecto contribuirá al avance de este conocimiento, en especial en cuanto a la regulación o modulación de la excitabilidad neuronal y su relación con la muerte de las neuronas y el papel que juegan el metabolismo energético mitocondrial y los procesos oxidativos, así como la apoptosis. El proyecto se basa en los modelos experimentales de excitotoxicidad in vivo que hemos desarrollado en nuestro laboratorio, particularmente en la médula espinal de la rata, por sobreactivación de los receptores de glutamato. El primer modelo de muerte de motoneuronas (MN) espinales es agudo, por perfusión AMPA, agonista de los receptores tipo AMPA, por microdiálisis; el segundo es crónico, por infusión lenta de AMPA durante varios días mediante minibombas osmóticas. Usaremos además la 4-aminopiridina (4-AP), un bloqueador de los canales de potasio que estimula la liberación de glutamato desde las terminales sinápticas. Planteamos ahora, además, el uso del rojo de rutenio, un colorante inorgánico que desde hace algunos años demostramos que produce hiperexcitación y neurodegeneración en el cuerpo estriado y en el hipocampo de la rata. Asimismo, es muy relevante conocer los posibles mecanismos de neuroprotección por drogas que actúan por diversos mecanismos. Entre ellos, hemos descrito un notable efecto protector del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), mediado por receptores localizados en las MN espinales, y ahora proponemos estudiar el fragmento C de la toxina tetánica, que se comporta como factor trófico y tiene efectos protectores, así como otras estrategias de protección, basadas en aumentar los sustratos oxidables en las mitocondrias, en bloquear la producción de ROS que se generan durante el proceso de excitotoxicidad, con bloqueadores de la NADPH oxidasa, en disminuir el estrés oxidativo con sulforafan, droga que incrementa la expresión de enzimas antioxidantes. Además estamos estudiando el efecto de activadores e inhibidores de las deacetilasas de histonas (sirtuinas), también con efectos protectores en otros modelos. Es poco lo que se sabe del posible papel de las neuronas inhibidoras en la médula espinal, en la modulación de la excitotoxicidad generada por sobrefuncionamiento de la transmisión excitadora glutamatérgica. Estas neuronas son principalmente GABAérgicas o glicinérgicas en la médula espina, por lo que estudiaremos el efecto de bloqueadores de los receptores GABA y glicina per se y en nuestros dos modelos experimentales de la degeneración de las motoneuronas. Los procedimientos experimentales que se emplearán han sido ya establecidos en el laboratorio, e incluyen microdiálisis, determinación de aminoácidos por HPLC, histología, inmunocitoquímica, western blots, microscopía electrónica y microscopía confocal.

CONTINÚA DE LA SECCION ANTECEDENTES Con base en todo lo anterior, en el presente proyecto nos proponemos continuar y profundizar en los diferentes aspectos descritos, mediante los siguientes diseños experimentales: 1. Para continuar con el posible efecto protector de los factores tróficos, estudiaremos en nuestro modelo crónico el efecto protector del fragmento carboxilo-terminal de la toxina tetánica, que es un péptido no tóxico de 50 kDa con acciones neurotróficas y con efectos protectores contra la neurodegeneración, tanto in vitro (Chaib-Oukadour et al. 2004) como in vivo, en un modelo murino de ALS familiar (Moreno-Igoa et al. 2010). 2. Además de completar los experimentos del efecto del AMPA y la protección por piruvato sobre la respiración, en mitocondrias aisladas del la médula espinal, mediremos también los cambios en el potencial de membrana mitocondrial. Estos experimentos se realizan en colaboración con el grupo del Dr. Salvador Uribe, del IFC. 3. Los experimentos con sustratos energéticos y los antioxidantes realizados hasta ahora han sido en el modelo agudo. Consideramos de interés estudiar si también protegen en el modelo crónico, que semeja más la ALS. Empezaremos con el en especial el beta-hidroxibutirato y el glutatión. 4. Se completará el estudio sobre el efecto de la apocinina, inhibidor de las NOX, pero examinando la relación del déficit motor, que es solo parcial, con la degeneración de los grupos neuronales motores del asta anterior, con los músculos que inerva cada grupo, y con los segmentos espinales adyacentes al sitio de infusión de AMPA, ya que hemos observado cierta selectividad topográfica en los grupos neuronales. 5. Con objeto de explorar si el bloqueo de la producción de ROS por antioxidantes indirectos, que actúan incrementando la expresión de enzimas antioxidantes, puede proteger las motoneuronas en nuestro modelo crónico, estudiaremos el efecto del sulforafán, un isocianato que se une al elemento de respuesta antioxidante y mediante este mecanismo tiene un efecto protector contra la neurodegeneración (Hu et al. 2004; Guerrero-Beltrán et al. 2010). 6. Continuaremos con el estudio del efecto crónico de la 4-AP sobre las MN espinales, caracterizando la respuesta muscular por EMG y variando la concentración de 4-AP. 7. Continuaremos estudiando el efecto del resveratrol, que apenas se inició, en el modelo crónico. 8. Completaremos los experimentos sobre el mecanismo de muerte, apoptótica o necrótica, comparativamente en nuestros modelos agudo y crónico. 9. Completaremos el estudio del bloqueo de las vías inhibidoras GABAérgicas y glicinérgicas, usando agonistas y antagonistas de sus receptores, como posible mecanismo de excitotoxicidad mediada por glutamato. 10. Realizaremos experimentos piloto para saber si el uso del rojo de rutenio, colorante inorgánico con intensos efectos de excitación y neurodegeneración en varias regiones del cerebro (Tapia 1982; Tapia y Flores-Hernández 1990; García-Ugalde y Tapia 1991; Tapia 1994; Belmar et al. 1995) puede ser una herramienta útil para estudiar los mecanismos de degeneración de las motoneuronas espinales. Epilepsia y mecanismos de muerte de las neuronas hipocampales De manera similar a lo descrito en los párrafos precedentes para la médula espinal, en los trabajos arriba citados y en los aquí citados hemos estudiado los mecanismos de neurodegeneración por excitotoxicidad en el hipocampo in vivo, por medio de la perfusión de 4-aminopiridina (4-AP), un bloqueador de los canales de K+ que estimula la liberación de glutamato desde las terminales sinápticas (Peña y Tapia, 1999, 2000; Tapia et al., 1999; Peña et al., 2002). En este modelo de la 4-AP en el hipocampo hemos encontrado recientemente lo siguiente (no menciono los múltiples hallazgos de años anteriores): 1) La perfusión por microdiálisis en el hipocampo de PDC (bloqueador del transportador de glutamato), junto con la 4-AP, en ratas despiertas, paradójicamente protege contra la epilepsia y la neurodegeneración producidas por la 4-AP, a pesar de un notable incremento en la concentración extracelular de glutamato. Esta protección es impedida por antagonistas de los receptores al glutamato metabotrópicos de tipo III, indicando que estos últimos receptores participan en la regulación de la liberación presináptica de glutamato. Este importante trabajo fue recientemente publicado (Vera y Tapia, 2012). 2) El piruvato protegió contra la neurodegeneración, pero no contra la epilepsia, producidas por la 4-AP. Se probaron además el lactato, el beta-hidroxibutirato (dos isómeros) y el acetoacetato, y todos ellos protegieron parcialmente, indicando que el déficit energético es un factor importante en el mecanismo de degeneración. 3) Sorprendentemente, la administración por microdiálisis hipocampal de los inhibidores de la glutamato descarboxilasa (GAD) que actúan disminuyendo la concentración de fosfato de piridoxal no tuvieron efectos significativos, ni epileptogénicos ni neurodegenerativos. Sin embargo, el ácido mercaptopropiónico sí produjo epilepsia. 4) Se terminó el análisis de los datos y publicó el trabajo sobre el efecto de la alopregnanolona sobre la excitotoxicidad producida por la 4-AP en el hipocampo (Salazar y Tapia, 2012). Con base en todo lo anterior, en el presente proyecto nos proponemos estudiar diferentes mecanismos de daño neuronal y de protección en nuestro modelo de 4-AP en el hipocampo. La mayor parte de estos experimentos se realizarán en ratas despiertas para evitar el efecto de los anestésicos, en cuya acción están involucrados los receptores glutamatérgicos y GABAérgicos. 1. Se completarán los experimentos sobre el efecto protector del piruvato, lactato, α-ceto-glutarato, β-hidroxibutirato, acetoacetato contra la excitotoxicidad producida por la 4-AP. 2. Se completarán los experimentos y el análisis de los resultados con el ácido 3-mercaptopropìónico. 3. El agonista específico para los receptores metabotrópicos tipo III, L-2-amino-4-fosfonobutirato (L-AP4), inhibe la liberación de glutamato en rebanadas estimuladas eléctricamente (Baskys y Malenka, 1991) al igual que en terminales nerviosas estimuladas con 4-AP (Rodríguez-Moreno et al., 1998). Estudiaremos por consiguiente el efecto de este agonista sobre la acción excitotóxico de la 4-AP en nuestro modelo in vivo.