Caracterización bioquímica de la activación de la cinasa de adhesión focal pp125FAK inducida por Trombina en células del Epitelio Pigmentado de la Retina (EPR). INTRODUCCIÓN. La cinasa de adhesión focal (pp125FAK), una cinasa de tirosina citoplásmica, promueve señales intracelulares que regulan funciones dependientes de la adhesión como la migración, la proliferación y la invasividad celular [1]. Particularmente, su función en patologías oculares proliferativas como la retinopatía diabética proliferativa y la vitreorretinopatía proliferativa que incluyen la transformación epitelio-mesénquima (EMT) de las células del EPR, su proliferación y migración, no se ha aclarado [2]. FAK y los receptores de integrinas se colocalizan en los sitios de contacto de las células con el sustrato [3]. Intracelularmente, FAK se asocia con múltiples proteínas de señalamiento como la familia Src de cinasas de tirosina, p130 Cas, Shc, Grb2, PI3K y paxilina, lo que permite su inclusión en vías de señalamiento activadas por integrinas, receptores acoplados a proteínas G y factores de crecimiento, que controlan la actividad de efectores como las MAPKs ERK y JNK [4]. Se ha demostrado que la estimulación de receptores acoplados a proteínas G promueve la activación de FAK a través de la GTPasa monomérica p21 Rho [5], aunque los efectores de Rho que median la activación de FAK se desconocen. La Vitreorretinopatía Proliferativa (VRP). La transformación de células epiteliales diferenciadas en células mesodérmicas se conoce como "transición epitelio-mesénquima" (TEM; 6). La VRP es una patología caracterizada por la proliferación acelerada y la TEM de las células del epitelio pigmentado de la retina (EPR) que se traduce en la formación de membranas celulares sobre ambas superficies de la retina, impidiendo el paso de luz; el desprendimiento de la retina debido a la contracción de las células transformadas produce la pérdida permanente de la visión [7]. Si bien se ha establecido la TEM como uno de los agentes causales de la VRP, tanto los receptores como las vías de señalamiento intracelular que desencadenan el fenómeno no han sido aclarados. Al respecto, se ha demostrado, que la trombina induce la proliferación y transformación de las células del epitelio pigmentado de la retina [8]. La trombina (Tr), una proteasa de Serina/Treonina, actúa a través de receptores transmembranales llamados PARs (receptores activados por proteasas). Nuestro trabajo previo ha demostrado que la estimulación de las células del EPR por Tr promueve la proliferación celular, la formación de fibras de tensión de actina y la migración, procesos centrales en el desarrollo de la VRP [10-12]. OBJETIVO: Investigar el efecto de la Trombina sobre la activación de FAK, su participación en la transformación morfológica del EPR característica de la VRP, y las vías de transducción involucradas en este proceso. METAS: I. Demostrar el efecto de la Tr sobre la activación de FAK. 2. Determinar su especificidad utilizando inhibidores de la Tr. 3. Identificar al PAR que media la activación de FAK, mediante agonistas específicos de los PARs 1-4. 4. Analizar el efecto de la inhibición de RhoA, RhoK, las PKC y la PI3K sobre la activación de FAK. 5. Analizar la función de FAK en la reorganización del citoesqueleto de actina inducida por Tr mediante inmunofluorescencia, en células transfectadas con siRNA para FAK. 6. Analizar el efecto de la activación de FAK por Tr sobre la formación de adhesiones focales mediante inmunocitoquímica, en ausencia y presencia de un inhibidor de Src. 7. Investigar la participación de FAK en la migración inducida por la Tr en células transfectadas con siRNA para FAK. Referencias: 1. Wozniak, M.A., et al., Biochim Biophys Acta, 2004. 1692: 103-19. 2. Casaroli-Marano, R.P., R. Pagan, and S. Vilaro, Invest Ophthalmol Vis Sci, 1999. 40: 2062-72. 3. Sastry, S.K. and K. Burridge, Exp Cell Res, 2000. 261: 25-36. 4. D.J. Webb, K. Donais, L.A. Whitmore, S.M. Thomas, C.E. Turner, J.T. Parsons, A.F. Horwitz, Nat. Cell Biol. 6 (2004) 154-161. 5. Raftopoulou, M. and A. Hall, Dev Biol, 2004. 265: 23-32. 6. Thiery, J.P. and J.P. Sleeman, Nat Rev Mol Cell Biol, 2006. 7): 131-42. 7 Pastor, J. C., de la Rua, E. R., and Martin, F. (2002). Prog Retin Eye Res 21: 127-44 8. Hackett, S.F., et al. Exp Eye Res, 1991. 53): 95-100. 9. Coughlin, S.R., Nature, 2000. 407: 258-64. 10. Ruiz-Loredo, A. Y., Lopez, E., and Lopez-Colome, A. M. (2011) J Cell Physiol 226: 414-23. 11. Parrales, A., Palma-Nicolas, J. P., Lopez, E., and Lopez-Colome, A. M. (2010). J Cell Physiol 22:, 302-12. 12. Palma-Nicolas, J. P., Lopez, E., and Lopez-Colome, A. M. (2010) J Cell Biochem 110: 948-67.

Nuestro trabajo previo ha demostrado que la estimulación de las células del EPR por la Trombina promueve la proliferación celular, la formación de fibras de tensión de actina y la migración, procesos centrales en el desarrollo de la VRP [21, 29, 30]. El presente proyecto se enfoca en investigar el efecto de la Trombina sobre la activación de FAK y la posible participación de esta enzima en la transformación morfológica del EPR característica de la VRP. Estadísticamente la VRP es la causa principal del fracaso de las cirugías de la retina que se realizan para reparar un daño, por lo que abordar la investigación descrita fortalecerá el papel fisiopatológico de la trombina como generador de daño a la retina en las lesiones oculares que involucran la ruptura de la barrera hematoretiniana y permitirá proponer mecanismos farmacológicos/bioquímicos para contrarrestar sus posibles efectos in vivo.