Realizar cultivos celulares empleando tecnología a micro-escala permite controlar algunas condiciones micro ambientales, tales como interacciones célula-célula y célula matriz extra celular, potencialidad de escalar experimentos, el empleo de pequeños volúmenes de reactivos y medios de cultivo, etc. En particular, la perfusión de cultivos basada en microfluídica permite la entrega y remoción controladas de moléculas bioquímicas solubles en el micro ambiente extracelular, así como la aplicación controlada de las fuerzas mecánicas ejercidas por el flujo de fluido. Sin embargo, existen aún muchos retos en el diseño y operación robusta de sistemas de perfusión que permitan realizar cultivos rutinarios de células de mamífero, tales como las células cardiacas. El desarrollo de sistemas microfluídicos de perfusión involucra análisis microfluídico, selección de materiales, configuración de los cultivos, fabricación de la red microfluídica y de micro ensayos, además de otras consideraciones como esterilización, alimentación celular tanto para configuraciones 2D y 3D y operación del sistema considerando optimización del transporte de masa, condiciones de esfuerzos cortantes y generación de burbujas de aire al interior de los micro canales. El estudio que se describe en este proyecto, permitirá la integración y sistematización del diseño y construcción de micro plataformas de cultivo de cardiomiocitos con sistemas de perfusión microfluídica. Se considerarán las implicaciones tanto del cultivo celular como de los micro ensayos a realizar con diferentes diseños microfluídicos, para lograr así las condiciones necesarias que sirvan como punto de partida para sistemas robustos de perfusión. Los resultados que arroje este proyecto representarán un avance en metodologías de vanguardia de cultivo celular in vitro, contando con modelos que imiten condiciones fisiológicas naturales de estas células y su ambiente in vivo de manera más precisa, valiéndonos para ello de las micro-tecnologías en substratos poliméricos.

La contribución de este proyecto será estudiar a detalle los efectos de la dinámica del flujo de perfusión con la actividad de los cardiomiocitos cultivados en chip. Este estudio básico nos servirá de herramienta fundamental en el establecimiento de un sistema microfluídico que optimice las condiciones de estudio celular en cultivo. Las bondades de esta herramienta controlada de cultivo no sólo se limitan a imitar algunas condiciones del micro ambiente, sino que los sistemas microfluídicos permiten integrar otros elementos de control mecánico como válvulas, elementos de control eléctrico como electrodos, lo que ya se ha hecho, y elementos ópticos de manipulación y sensado. Esto permitirá hacer estudios a escala celular y subcelular, en particular de investigación básica bio-mecánica relevante. En la actualidad, se sabe que el substrato en el cual se expresan los procesos biomecánicos celulares lo constituye el cito-esqueleto, un delicado entramado de filamentos de proteína que recorre todo el interior celular e incluso alcanza al núcleo; que se comunica directamente con proteínas estructurales de la membrana y de la matriz extracelular que la rodea. Si se ejerce una fuerza sobre un costado de una célula, se provoca una distorsión que será transmitida a todo su largo y en diversas direcciones rápidamente. Tal distorsión se convierte en una señal para moléculas específicas que pueden iniciar o interrumpir un proceso celular. Las moléculas que están siendo foco de atención reciben el nombre de integrinas, pues forman parte de la membrana celular [1] [27]. Incluso se ha visto que si una fuerza controlada se aplica durante etapas de desarrollo en una célula germinativa, se puede inducir su diferenciación a determinado tipo celular. Las implicaciones clínicas de estas posibilidades de control son enormes, así como las capacidades biotecnológicas, pues se podrían diseñar otros dispositivos no biológicos basados en la comprensión de las propiedades mecano-sensoras de polímeros. Por todo esto, contar con sistemas en los que se pueda manipular el substrato de crecimiento o la perfusión controlada de nutrientes y otras señales bioquímicas y mecánicas, representa un aporte metodológico de vanguardia. Es por esto que se ha despertado un gran interés en las áreas de biología celular cardiaca e ingeniería de tejido, cuyos avances pueden impactar directamente en medicina regenerativa. En este sentido, las bondades de la micro-tecnología están permitiendo un revolucionario mejoramiento de las capacidades actuales de la experimentación biológica y biomédica. Las plataformas microfabricadas son elementos ideales para afrontar los retos presentes en estudios celulares y subcelulares debido a la afinidad en las escalas dimensionales. Además, el uso de esta tecnología emergente orientada a desarrollar sistemas en chip, permitirá una sistematización en el desarrollo y análisis de agregados celulares y cultivos con geometrías confinadas, logrando además mayor portabilidad y ahorro de insumos químicos y biológicos en varias órdenes de magnitud (e.g. nano y pico litros en cada micro-canal). Por otro lado, la cantidad de información y de tecnologías emergentes crece a pasos acelerados. La mayoría de las veces los centros de investigación y desarrollo no cuentan con la infraestructura física y los recursos humanos adecuados para incorporar tecnologías de punta a sus procesos de investigación. Dentro de las ventaja que presentan los micro dispositivos poliméricos, además de sus propiedades ópticas y de biocompatibilidad, etc., resalta de manera importante el que su producción no requiere de inversiones del orden de millones de dólares, como ocurre para el caso de los micro-sistemas de Silicio. Este proyecto es consecuencia de un proyecto anterior, mencionado en los antecedentes, sobre la utilización de tecnología BioMEMS para cultivo de células cardiacas, IACOD-DGAPA IC10031. En este se exploró en la integración de diferentes capacidades funcionales de tipo modular, en una misma micro-plataforma de cultivo; como el módulo de inserción de electrodos y micro pozos para confinamiento de los agregados celulares semi-esféricos y la inclusión del sistema de perfusión por microfluídica. Todo esto con base en una técnica de muy bajo costo y presupuesto limitado, pero que nos permitió hacer prototipos de acercamiento, aprendizaje y exploración al uso de esta tecnología en cultivos de cardiomiocitos. Es claro que para lograr modelos similares al micro-ambiente celular se requiere de mayores resoluciones y alta repetitividad. Gracias a apoyo recibidos por CONACYT-SEP convocatoria 2010 y el ICYTDF 2011 se pudo adquirir una herramienta de foto litografía libre de máscaras que permitirá fabricar micro estructuras de 1-3 micrómetros de resolución. Con el apoyo solicitado en esta convocatoria, se busca completar la infraestructura del Centro UNAMems de la Facultad de Ingeniería, ya que no se cuenta aún con algunos equipos menores, en relación al equipo de fotolitografía cuyo costo ascendió a 83,000 USD, pero que son indispensables para el proceso de litografía suave con el que se construyen los micro-dispositivos de polímero. Además de contar con becas para alumnos de licenciatura que siempre son vitales en el desarrollo del proyecto, así como insumos y materiales necesarios en la vida cotidiana experimental, se requiere de un spin coater que genere películas delgadas de polímero, para depositar tanto las resinas fotosensibles involucradas en el proceso de litografía óptica, como capas uniformes de espesores controlados de PDMS que conformará el chip de cultivo, un horno de secado tanto para la cristalería como para obtener polimerización uniforme. Se requiere también un horno para el cocido de las resinas fotosensibles y polimerice el PDMS, una campana de extracción donde se coloque este sistema recubridor giratorio, ya que los solventes de limpieza y de revelado son tóxicos así como el tratamiento de superficies para el sellado con corona tesla que produce ozono. Con estos equipos estaremos listos para comenzar a desarrollar tecnología de polímeros a micro escala de alta resolución. También queremos resaltar el hecho de que con este proyecto se favorecerá la actividad multidisciplinaria inter-institucional. La capacitación y formación de recursos humanos es una de las prioridades de los investigadores involucrados en el proyecto. Los alumnos y académicos tendrán la posibilidad de aprender a utilizar tecnologías de punta para el desarrollo y estudio de aplicaciones biológicas y biomédicas, que les permitan expandir el rango de posibilidades experimentales. Con ello se enriquecería el conocimiento y la investigación en particular de cultivos celulares cardiacos en plataformas micro tecnológicas, que resultarán en prototipos de gran impacto en ciencia básica y en un futuro en la ingeniería de tejidos.