A las proteínas se les ha clasificado, con justeza, las máquinas de la vida ya que intervienen en (y determinan) una multitud de procesos tales como: (a) catalizar reacciones químicas que por sí mismas no podrían ocurrir lo suficientemente rápido a condiciones fisiológicas para sostener la vida, (b) transportar desde macromoléculas hasta electrones, haciendo posible el vital proceso de la fotosíntesis, transmitiendo información entre células y órganos en organismos complejos, controlando el paso de moléculas a través de las membranas de las células y organelos, protegiendo, como parte del sistema inmune, contra la acción de moléculas y organismos ajenos, (3) controlar la expresión de los genes uniéndose a sitios específicos en las secuencias de ácidos nucleicos, y de esta manera "enciender" y "apagar" la expresión genética; (4) convertir energía química en energía mecánica en músculos y otros sistemas. El paradigma actual en el estudio de las proteínas establece que sus muy diversas propiedades funcionales pueden comprenderse al profundizar en entendimiento de la relación entre su estructura tridimensional y sus funciones biológicas. Este conocimiento requiere de la interacción entre muchas disciplinas científicas tales como la física, la química, la bioquímica, la biología, etc. En este esfuerzo se han formado también sub-disciplinas que, uniendo partes de las disciplinas mencionadas, se especializan en estudiar algunos aspectos de las proteínas. Tal es el caso de la bio-fisicoquímica que emplea los métodos experimentales de la fisicoquímica al estudio de sistemas bioquímicos y cuyas herramientas teóricas son la termodinámica clásica, la cinética y la termodinámica estadística. Este proyecto de investigación se ubica en área de la bio-fisicoquímica. En él se plantea hacer investigación básica en los siguientes tres aspectos del estudio de las proteínas: (1) estabilidad termodinámica y cinética de las proteínas, (2) cinética enzimática y (3) las interacciones entre proteínas y (a) bi-capas lipídicas (liposomas o vesiculas) que modelan a las membranas y (b) moléculas que son capaces de interaccionar (sin que ocurra una reacción química) de manera específica con ciertos amino ácidos. El propósito fundamental esta investigación es avanzar en el conocimiento de las bases energético estructurales que determinan las interacciones en sistemas bioquímicos. Para ello, se empleará un enfoque multidisciplinario que combine técnicas propias de la fisicoquímica, como las calorimetrías y las espectroscopías, con las herramientas de la bioquímica y la biología molecular. Los sistemas a estudiar serán diversas proteínas que se sobre-expresarán y purificaran por métodos ya bien establecidos en años previos. De los resultados originales que se generen en el desarrollo de este proyecto, se obtendrá material suficiente para que 2 alumnos de licenciatura, 1 de maestría y 2 de doctorado se gradúen. En algunos aspectos del proyecto se colaborará con colegas académicos de la UNAM y fuera del país (ver Objetivos). Los hallazgos más importantes y relevantes se publicaran en revistas internacionales con arbitraje estricto. El Laboratorio de Bio-fisicoquímica de la Facultad de Química ya cuenta con los equipos mayores necesarios para el desarrollo del proyecto y todos los alumnos de posgrado cuentan con beca del CONACyT. Por estas razones, este proyecto se limita a solicitar recursos sólo para gastos de operación, gastos de intercambio, así como para viáticos y pasajes para asistir a congresos nacionales e internacionales en el área

En este apartado se describen las motivaciones puntuales o específicas para hacer la investigación básica que se propone, los sistemas con los que se llevaría a cabo y las contribuciones que esperan lograrse. Esta información se presenta para los tres sub-proyectos. I.- ESTABILIDAD TERMODINÁMICA Y CINÉTICA DE PROTEÍNAS El control cinético de la transformación del estado nativo al desnaturalizado de una proteína queda caracterizado por una barrera energética. Trabajos teóricos sugieren que las barreras energéticas son barreras de solvatación. Si, como parece ser el caso de las proteasas, existe una presión evolutiva selectiva asociada a la estabilidad cinética, una pregunta interesante es: ¿son las barreras de solvatación de proteínas que comparten estructura y función iguales o distintas?. Para responder, recientemente se estudiaron a las triosafosfato isomerasas (TIMs) de tres organismos,[ref 21 en Antecedentes]: trypanosoma cruzi (TcTIM), trypanosoma brucei (TbTIM) y leishmania mexicana (LmTIM). Se encontró que a pesar de que las secuencias de amino ácidos de estas TIMs no difieren mucho (tienen alta homología), la TcTIM tiene una energía de activación 2.5 veces mayor a la de TbTIM. De este hallazgo surge la pregunta a contestar: ¿cuáles son las regiones son responsables de la gran diferencia en estabilidad cinética entre ellas ? Para contestar esta pregunta se plantea utilizar proteínas quiméricas. Una quimera es una proteína, que no existe en la naturaleza pero que podemos crear en el laboratorio, que está formada por sectores de otras proteínas. Las secuencias de amino ácidos de la TcTIM y la TbTIM se dividen en 8 regiones, cada una con una hebra beta, un asa y una hélice alfa. Tomando como base la secuencia de TcTIM se sustituiran secuencial y aditivamente regiones correspondientes de TbTIM, para irla transformando paulatinamente en TbTIM. La pregunta a contestar es entonces: ¿ cuántas y cuáles regiones de TbTIM hay que sustituir por las de TcTIM para que la estabilidad cinética de la quimera aumente al nivel de la que posee TcTIM ?. Se espera que la comparación entre las estabilidades cinéticas (energías de activación) obtenidas de experimentos de DSC de las proteínas nativas originales (TcTIM y TbTIM) y las quimeras logren contestar la pregunta planteada. Complementariamente, se planea hacer simulaciones de dinámica molecular de TcTIM y TbTIM y de aquellas quimeras que resulten más importantes. II.- CINÉTICA ENZIMÁTICA La aplicación de la calorimetría de titulación isotérmica a la determinación de cinéticas enzimáticas (ver Antecedentes) se hizo usando ésteres derivados de arginina y lisina catalizada por la enzima tripsina. Entre otras, las ventajas que tiene el empleo del ITC son: es capaz de determinar la cinética de sustratos que no pueden estudiarse espectroscópicamente y puede detectar valores de las constantes de velocidad de reacción en un amplio rango (1 microM a 5 mM). En el presente sub-proyecto se pretende caracterizar la cinética de la tripsina con tres sustratos más, todos imposibles de determinar espectroscópicamente (una tesis de Licenciatura) y desarrollar el trabajo de investigación que a continuación se describe. El estudio y caracterización de las propiedades promiscuas de las enzimas puede, como se discutió en la sección de Antecedentes, utilizarse para identificar posibles eventos evolutivos. Comprobada ya la eficacia del ITC en el estudio de la cinética enzimática de la tripsina, pretendemos utilizar esta técnica en la caracterización cinética de la promiscuidad catalítica de la sulfatasa SdsA1 de Pseudomonas aeruginosa, cuyas reacciones no pueden estudiarse directamente. La Pseudomonas aeruginosa es un patógeno capaz de utilizar la molécula de dodecil sulfato de sodio (SDS), abundante en los desagües por su empleo en detergentes y jabones, como fuente de azufre y carbono mediante hidrólisis de SDS. Con la intención de resolver la interrogante de si la promiscuidad de las enzimas es un proceso debido principalmente al reconocimiento del sustrato por la enzima o bien al tipo de enlace a hidrolizar, hemos diseñado un conjunto de sustratos promiscuos, todos ellos ciegos a espectroscopía. Su estudio por ITC con la sulfatasa SdsA1, permitirán conocer las constantes de velocidad y las energías de activación de cada paso de catálisis. Se harán, además, experimentos dirigidos a corroborar el mecanismo propuesto de reacción que, en conjunto con aquellos correspondientes a la caracterización de las interacciones enzima-sustrato a través de experimentos clásicos de unión por ITC, serán cruciales en la determinación del paso (o pasos) responsable del comportamiento promiscuo de esta enzima. III.- INTERACCIONES PROTÉINA-LIPOSOMA Y PROTEÍNA-CICLODEXTRINA PROTÉINA-LIPOSOMA Construyendo algunas de las proteínas quimericas ya mencionadas, se tienen ya indicios de que la región 5 de la TcTIM y TbTIM (aminoácidos 120 a 161) es probablemente crucial para su estabilidad cinética. En los parásitos, a diferencia de la TcTIM, la TbTIM debe cruzar una membrana para llegar al sitio donde participa como enzima en la glucolisis. Se ha reportado que se necesitan un mínimo 22 residuos (péptido señal) para que ocurra este transporte al glicosoma. Esta secuencia es del aminoácido 140 al 161 y se encuentra comprendida por la región 5. Se plantea entonces la hipótesis de que la región 5 de TbTIM está “diseñada evolutivamente” para que la TbTIM pueda cruzar la membrana a expensas de tener una estabilidad menor. En este proyecto se pretende poner a prueba esta hipótesis estudiando las interacciones entre TcTIM y TbTIM con modelos de membrana (liposomas) que serán construidos usando los lípidos DMPC y DPPC. Asi mismo, se pretende estudiar las interacciones entre los péptidos de los 22 amino ácidos “señal” de TcTIM y TbTIM con dichos liposomas. Este estudio se llevara a cabo empleando DSC y dicroísmo circular. PROTEÍNA-CICLODEXTRINA El empleo simultaneo del desnaturalizante químico urea y calor es también una herramienta útil para avanzar en el conocimiento del fenómeno de plegamiento y desplegamiento de las proteínas. En un experimento DSC de una proteína en presencia de urea se observa que el rango de temperaturas donde la transición ocurre se desplaza hacia temperaturas menores. La alfa-ciclodextrina (aCD) es también un desnaturalizante, que actúa sobre la proteína de manera diferente a la urea. La desestabilización de las proteínas en presencia de aCD puede deberse a que la aCD atrapa en su interior algunos de los amino ácidos que se encuentren expuestos al solvente: los hidrofóbicos y los cargados ya que estos últimos pueden estar protonados o no dependiendo del pH del medio. Se plantea entonces que cambiando el pH es posible modular el efecto neto de la aCD sobre la desnaturalización térmica de la lisozima, mediante la formación de diferentes (en número y en energía de formación) complejos de inclusión aCD/amino ácido, y avanzar con ello en la comprensión del proceso.